热休克转录因子4基因突变致先天性白内障分子机理研究

发布时间：2019-11-19 16:23

【摘要】： 背景 热休克转录因子4(heat shock transcription factor 4,Hsf4)被认为是一种新的与白内障发生相关基因,在Hsf4 DNA结合域或其它调节域的错义突变与人先天性或家族常染色体显性或隐性遗传性白内障密切相关,这些基因突变与动物先天性白内障发生也密切相关,小鼠模型中Hsf4基因缺失可妨碍晶状体上皮细胞增殖和纤维细胞终未分化,从而导致出生后晶状体核白内障。 Hsf4有Hsf4a、Hsf4b两种亚型,Hsf4b是调节鼠晶状体发育中唯一亚型,已报道Hsf4b基因缺失不仅可以下调许多热休克蛋白(例如:Hsp25γ-晶体蛋白,β-晶体蛋白和骨骼肌蛋白)的表达,而且可以上调鼠晶状体组织中许多基因的表达(例如:FGF家族成员),这些研究表明Hsf4b通过对其下游靶基因转录激活和转录抑制双重作用而调控晶状体发育,但是,调节Hsf4b转录活性的信号通路还不清楚。 目的 探讨Hsf4调控晶状体发育的分子机制。通过探究Hsf4在上述信号转导通路中的作用,揭示Hsf4基因突变所致先天性白内障的致病机理,为早期诊断和治疗Hsf4突变相关的先天性白内障提供理论依据。 方法 用人心脏cDNA文库为模板,应用囊括Hsf4b全长的引物进行PCR并在Hsf4bcDNA的N-端加入Flag标签。将PCR产物经Kpn I和EcoR I酶切后,与该二酶线性化pcDNA3.0质粒一起连接获得重组质粒pcDNA-Flag-Hsf4b,将克隆好的pcDNA-flag-Hsf4b转染HEK293T细胞,并用抗Flag抗体进行免疫印迹分析,免疫沉淀实验和体内Pull down实验证明Hsf4b可与MAP激酶P38结合,激酶实验结果显示P38可体外磷酸化Hsf4b。 用Hsf4-/-小鼠的晶状体上皮细胞转染SV40,T-抗原,G418筛选建立永生化细胞系MLEC/Hsf4-/-。应用不同的含有CMV启动子的质粒(如腺病毒载体),在mLEC细胞和其他细胞系中表达Hsf4b,测定Hsf4b对CMV启动子的抑制作用。DNA-蛋白沉淀实验和DNA-蛋白结合实验体外测定Hsf4b与CMV启动子的结合。免疫印迹检测Hsf4b/S299磷酸化抑制Hsf4b的转录活性,免疫沉淀和细胞内GST pull down实验证明Hsf4蛋白可以结合转录抑制调节因子Daxx,免疫荧光染色实验发现Hsf4b被摹集到核内Daxx的POD核小体内。 结果 成功构建热休克转录因子4b (Hsf4b)的真核表达载体并在真核细胞HEK293T中表达,研究发现Hsf4b可与MAP激酶P38结合,Hsf4b的C-端转录调控区参与和P38的结合, P38可体外磷酸化Hsf4b。 Hsf4b具有转录抑制功能,Hsf4b可与CMV启动子中176bp处TTC(HSE序列)的序列直接结合,抑制CMV启动子活性,把此序列中TTC突变为GCC可抑制Hsf4b对CMV活性的负性调节作用。Hsf4b转录抑制功能通过与转录抑制调节因子Daxx结合实现,Hsf4b被摹集到核内Daxx的POD核小体内,Hsf4b与Daxx的结合受Hsf4b/S299磷酸化调控。 结论 实验首次证明Hsf4b与P38结合而被磷酸化,并且发现Hsf4b具有转录抑制功能,Hsf4b/S299磷酸化可调控Hsf4b与Daxx结合从而调控Hsf4b转录抑制活性。为进一步探讨Hsf4b在晶状体发育过程中的作用提供了新的信号通路。
【图文】：

15图1 重组质粒pCDNA3-flag-hsf4b 的酶切鉴定Fig 1 Identification of pCDNA3-flag-hsf4b by enzyme digestion1: DNA Marker; 2: pCDNA3-flag-hsf4b; 3and4:pCDNA3-flag-hsf4b / EcoR I and Kpn11.4.2 Hsf4b 在 HEK 293T 细胞中的表达我们将克隆好的pcDNA-flag-Hsf4b 转染HEK 293T细胞，并用抗Flag抗体进行免疫印迹分析。结果显示，，转染pcDNA-Flag-Hsf4b 质粒的细胞 在60KD处表达两条Hsf4b带（图2,泳道2),上面条带为磷酸化Hsf4b[12]，下面条带为Hsf4b; 而转染pcDNA3.0空质粒的HEK293细胞则没出现新的蛋白条带( 图2, 泳道1) , 说明重组表达质粒可以在真核细胞中有效表达。

图2 pCDNA3-flag-hsf4b 转染HEK293T 细胞表达的Wes tern blot 分析Fig2 Expression of pCDNA3-flag-hsf4b detected by Western blot1.4.3 Hsf4b 结合 MAP 激酶 P38已有报道， Hsf4 受磷酸化调控，Hsf4b 可结合MAP 激酶 Erk1/体外磷酸化[12]。为进一步探讨Hsf4b 是否受其他MAP激酶家族成员的了免疫沉淀试验。将pcDNA3 空质粒和pcDNA-Flag-Hsf4b 分别转入H中，用抗Flag 抗体作免疫沉淀。结果发现Hsf4b 可与细胞内源的p3起免疫共沉淀（图3，泳道 2 ）。而转染空质粒则不能沉淀P38蛋白（图3上部第三泳道为细胞裂解液中内源P38 的表达， 用于阳性对照。疫沉淀的Hsf4b 蛋白。结果说明Flag-Hsf4b和P38可以结合。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R776.1

【共引文献】

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本文编号：2563146