c-Myc及CyclinA2基因诱导大鼠耳蜗前体细胞增殖的体外研究

发布时间：2019-11-24 07:44

【摘要】： 在成年哺乳动物耳蜗中,听觉毛细胞和神经元损伤后不能再生,这成为感音神经性聋难以治愈的主要原因。近年来,自新生鼠耳蜗分离出前体细胞,在体外可定向分化为表达毛细胞和螺旋神经元表型的细胞。我们在体外比较了P1、P7和P14的大鼠耳蜗前体细胞的数量、增殖能力及超微结构,结果表明出生后耳蜗前体细胞大部分处于细胞周期的静止期,并逐步通过分化和凋亡彻底地退出了细胞周期,耳蜗前体细胞也并非真正意义上的干细胞,而是处于干细胞与成熟子代细胞之间的中间细胞或是处于干细胞未端的细胞。通过实验发现c-Myc可能参与调控耳蜗的发育以及前体细胞的增殖、分化。结合之前的工作基础,我们利用腺病毒技术将c-Myc和cyclin A2共转染至新生鼠耳蜗前体细胞,可使其增殖,并促进前体细胞重新进入细胞周期。初步研究其调控机制,表明为经典的CKI-cyclin-CDK途径。实验一大鼠耳蜗前体细胞的分离、培养目的对新生大鼠耳蜗前体细胞进行分离、培养。方法从P7大鼠耳蜗中分离、培养前体细胞,用免疫细胞化学的方法对前体细胞进行鉴定;血清诱导分化后鉴定分化潜能,进一步了解其多向分化特性。结果原代培养的细胞,培养1天后即可见“细胞球”,随着培养天数的增加,可见细胞球体积增大,所含细胞增多;培养5天后,少部分细胞球内的细胞出现分化及贴壁现象。细胞球内大部分细胞呈nestin、musashi1和BrdU阳性,表明其具有自我更新及有丝分裂的能力。细胞球经诱导分化14 d后,对分化细胞行免疫细胞化学鉴定,发现分化细胞表达毛细胞标志物myosin VIIA和phalloidin,表达成熟神经元标志物NeuN,表达不成熟神经元标志物Tuj1,表达星形胶质细胞标志物GFAP,表达少突胶质细胞标志物galactocerebroside,以及谷氨酸能神经元标志物GluR-1,证明其具有多向分化潜能。结论本部分实验为研究耳蜗前体细胞成年后“沉默”的机制奠定基础,为研究通过基因治疗的方法促进前体细胞增殖提供了一种体外模型。实验二不同日龄大鼠耳蜗前体细胞增殖能力及超微结构的比较目的耳蜗前体细胞在成年后沉默或消失的具体机制尚不清楚,为探讨其原因,我们在体外比较了P1、P7和P14的大鼠耳蜗前体细胞的数量、增殖能力及超微结构,观察耳蜗前体细胞的转归。方法对P1、P7和P14分离出的耳蜗前体细胞,经体外培养7天后进行计数,检测其数量变化,并每隔5天传代观察传代数;采用流式细胞技术检测细胞周期,来评估不同日龄新生大鼠耳蜗前体细胞增殖能力的变化;应用透射电镜观察不同日龄新生大鼠耳蜗前体细胞的超微结构。结果出生1周后耳蜗前体细胞的数量急剧下降,出生2周后的耳蜗内未能分离出前体细胞;P7前体细胞的传代数较P1减少;P7较P1更多的前体细胞处于有丝分裂的静止期,增殖指数下降;P7的前体细胞超微结构中有更多分化细胞的特点。结论耳蜗前体细胞出生后大部分处于细胞周期的静止期,并逐步通过分化和凋亡彻底地退出了细胞周期,他们并非真正意义上的干细胞,而是处于干细胞与成熟子代细胞之间的中间细胞或是处于干细胞未端的细胞。实验三c-Myc在大鼠耳蜗组织发育和耳蜗前体细胞分化过程中的表达变化目的原癌基因c-Myc具有调控G0/G1转换和去分化的双重作用。目前对于c-Myc在内耳中的功能尚未见报道。我们拟通过检测c-Myc在大鼠耳蜗组织发育及前体细胞分化过程中的表达情况,探讨其在哺乳动物耳蜗发育中的作用。方法1、取E10、E15、P1、P7和P14的SD大鼠耳蜗组织,应用RT-PCR、Western blot的方法检测c-Myc在大鼠耳蜗组织发育过程中的表达情况。2、取耳蜗前体细胞和分化7天后的分化细胞,用RT-PCR、免疫细胞化学染色和Western blot的方法检测c-Myc在耳蜗前体细胞分化过程中的表达情况。结果从胚胎至出生后的耳蜗发育过程中,c-Myc表达量呈现逐渐下降趋势;在前体细胞的分化过程中c-Myc的表达量也呈现下降。结论c-Myc的表达量在大鼠耳蜗组织发育及耳蜗前体细胞分化的过程中逐渐下降,这表明c-Myc可能参与调控大鼠耳蜗组织的发育及前体细胞的分化。实验四Ad-c-Myc-EGFP和Ad-CyclinA2-EGFP的构建和转染耳蜗前体细胞的浓度确定目的构建目的基因分别为c-Myc和CyclinA2的腺病毒载体,体外转染大鼠耳蜗前体细胞,观察转染效率及细胞活性,确定适当的转染浓度。方法1、构建复制缺陷重组腺病毒: Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP及Ad-EGFP;2、在不同效靶比浓度下(MOI=50、100、150、200、250),Ad-EGFP转染耳蜗前体细胞,观察不同浓度转染时细胞形态变化,荧光显微镜观察EGFP表达情况,计算阳性细胞百分率;3、应用MTT观察细胞活性确定增殖点;4、确定MOI值,应用流式细胞仪检测转染效率。结果毒种上清液经PCR鉴定,能够特异地扩增出预期大小的条带,证明该重组腺病毒携带目的片段。在不同效靶比浓度下,EGFP阳性细胞百分率随MOI值的升高而增大;当MOI=50,100,150时重组腺病毒对细胞的毒性作用与对照组相比无显著差异;当MOI值=200时,细胞状态不佳,出现生长抑制。根据光镜下细胞形态学证据,确定本实验采用MOI值为150。经MTT法测定,细胞生长曲线呈S形,转染后36小时做为增殖点,应用流式细胞技术检测转染效率为25.2%。结论复制缺陷型腺病毒可有效转染原代培养的耳蜗前体细胞,为进一步研究c-Myc和CyclinA2基因对耳蜗前体细胞增殖能力的影响奠定了基础。实验五c-Myc、CyclinA2基因对耳蜗前体细胞增殖能力的影响目的耳蜗前体细胞在体外具有一定的增殖能力,可定向分化为表达毛细胞和神经元表型的细胞,但耳蜗前体细胞增殖能力差,并处于细胞周期的“静止”状态。我们用编码目的基因为c-Myc和CyclinA2的腺病毒表达载体转染耳蜗前体细胞,促进其增殖并重返细胞周期,从而为诱导耳蜗受损细胞再生提供新的思路和依据。方法分别设立Ad-CyclinA2-EGFP转染组、Ad-c-Myc-EGFP转染组、Ad-EGFP转染组及Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP共转染组;用复制缺陷腺病毒转染大鼠耳蜗前体细胞,MOI值为150,用流式细胞技术检测c-Myc和CyclinA2基因对耳蜗前体细胞周期的影响;BrdU孵育观察转染后有丝分裂能力的变化;观察各组传代能力变化,采用方差分析对数据进行统计学处理。结果流式结果表明Ad-CyclinA2-EGFP转染组、Ad-c-Myc-EGFP转染组、Ad-EGFP转染组对耳蜗前体细胞周期无明显影响;而Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP共转染组可使部分耳蜗前体细胞进入G1/S期和G2/M期,共转染组与对照组G0/G1期细胞比例分别为62.03±2.02%、78.27±6.09%(P㩳0.05);增殖指数分别为37.97±2.015、20.41±7.16(P㩳0.05)。共转染组中共表达绿色荧光(EGFP)、红色荧光(BrdU阳性)及蓝色荧光(Hoechst)的细胞球数量增多,表明共转染c-Myc、CyclinA2使更多的耳蜗前体细胞具有有丝分裂的能力;各组间传代能力无明显变化。结论c-Myc基因和CyclinA2基因单独作用于耳蜗前体细胞,在体外对细胞增殖与细胞周期无明显影响。而c-Myc和CyclinA2基因共同作用于耳蜗前体细胞,可促进细胞增殖,使部分前体细胞重返细胞周期。实验六c-Myc与CyclinA2基因促进耳蜗前体细胞增殖的作用机制目的研究c-Myc和CyclinA2基因共同转染耳蜗前体细胞后,检测目的基因表达情况以及促进细胞增殖的机制。方法应用real-time PCR和Western blot的方法观察转染Ad-EGFP与共转染Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP时目的基因、PCNA、CDK2以及P27KIP1在细胞中的表达水平变化。结果real-time PCR和Western blot结果证实携带目的基因的腺病毒转染耳蜗前体细胞后能有效表达出相应的mRNA和蛋白;并可升高PCNA与CDK2的表达水平,降低P27KIP1的表达水平。结论复制缺陷型腺病毒可有效介导c-Myc和CyclinA2基因转染原代培养的耳蜗前体细胞,并通过上调细胞周期蛋白依赖激酶CDK2,下调CDK抑制蛋白P27KIP1,进而上调细胞DNA合成期标志蛋白PCNA来实现耳蜗前体细胞增殖的作用,其作用机制为经典的CKI-cyclin-CDK途径。
【图文】：

再生毛,感觉细胞,有丝分裂,细胞

图 2.毛细胞，我们利用非感觉细胞通过有丝分裂分有丝分裂转分化为新生毛细胞。不成熟细胞是胞分化的能力，他们可能来自大小上皮嵴。而前体的较好的候选细胞，他们能通过转分化再生也被作为一种良好的选择。前庭前体细胞特点是他们有自我更新的能力并且可分化成为细胞从成体组织中也被分离认证。Li等[18, 19]从细胞特点的细胞，急性分离后，这些细胞增殖体外培养8天后，这些细胞nestin表达阳性。Ne细胞和发育早期及出生后早期外周、中枢神经[21]

耳蜗,细胞数,细胞,独立实验

-56-图 1 P1、P7 和 P14 新生 SD 大鼠耳蜗前体细胞在培养 7 天后进行细胞及细胞球计数，细胞数/耳蜗，，细胞球数/104cells。结果来自三个独立实验，以均数±标准差表示。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R764

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