D-半乳糖诱导螺旋神经节细胞ROS聚集及其与衰老和DNA甲基化的关系研究

发布时间：2019-11-27 20:11

【摘要】：目的：探讨氧自由基聚集对体外培养的螺旋神经节细胞的损伤机制及其与衰老和DNA甲基化的关系。 方法：取出生后2—3天的SD乳鼠耳蜗,精细分离出Rosenthal管,建立螺旋神经节细胞(SGN)的体外培养模型,并对培养的SGN进行光镜下观察及免疫荧光鉴定。将SGN分为三个组：对照组为体外培养9天的SGN；D-半乳糖(D-gal)组为自然培养4天后用含D-gal的培养基继续培养5天；自然衰老组为体外正常培养30天的SGN。通过CCK8检测筛选D-gal的作用浓度,流式检测技术检测细胞内的ROS水平,RT-PCR检测mtDNA4834缺失突变率,β-半乳糖苷酶染色法观察对照组、D-gal组和自然衰老组的SGN衰老染色程度,激光共聚焦显微镜下观察Dnmtl,TFAM,NRF1在螺旋神经节细胞内的表达及定位,RT-PCR检测Dnmtl,PGC-1α,BDNF mRNA在对照组、D-gal组和自然衰老组的表达水平。 结果：纯化后的螺旋神经节细胞NF200及NeuN染色阳性,部分SGN TUJ1染色阳性。CCK8检测示D-gal在25mg/ml作用24h对SGN细胞增殖率的影响与对照组相比具有统计学差异(P0.05),而渗透压对照组D-葡萄糖和甘露醇分别在30mg/ml和35mg/ml时对SGN增殖率的影响具有统计学差异。20mg/ml的D-gal作用5天后螺旋神经节细胞ROS水平较对照组升高约20%,差异具有统计学意义。D-gal组和自然衰老组与对照组相比mtDNA4834缺失突变率变化无统计学差异。随着培养时间的延长,SGN β-半乳糖苷酶染色程度逐渐加深,而D-gal组和对照组之间的差异并不显著。DNMT1和PGC-1α在D-gal和自然衰老组转录水平上与对照组相比差异无统计学意义,而BDNF在D-gal组和自然衰老组其mRNA水平较对照组均明显上升。 结论：20mg/mlD-半乳糖可以诱导螺旋神经节细胞内ROS水平升高,但螺旋神经节细胞并未出现加速衰老的现象。与调节线粒体功转录功能相关的PGC-1α及与维持DNA甲基化水平相关的DNMT1在mRNA水平也并未出现明显变化。结合前期D-半乳糖所诱导的大鼠拟老化模型及边缘细胞的体外衰老模型,D-半乳糖可能更适合建立一种代谢性耳聋模型。要建立螺旋神经节细胞的体外加速衰老模型,我们需要寻找新的方法。
【图文】：

华中科技大学博士学位论文6 D-gal浓度：20mg/ml.D-gal组3 -半乳糖苷酶染色程度与对照组相比差异显著。而自然衰老组与对照组相比，，￠-半乳糖苷酶染色则明显加深.、 Dnmtl , NRF1 ,Tfam免疫焚光染色
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764.43

【参考文献】

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1 孔维佳;胡钰娟;王琼;许黎;王莹;韩月臣;李隽;刘波;孔雯;;大鼠内耳拟老化伴线粒体突变模型的建立[J];临床耳鼻咽喉科杂志;2006年19期

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本文编号：2566746