角膜内皮细胞压力调控及高压力损伤机制的研究

发布时间：2020-01-26 17:41

【摘要】： 目的: 本研究拟通过体外压力培养平台,分析不同压力梯度下角膜内皮细胞的形态和结构特点,以及其生物学功能的变化规律。探讨正常眼压对角膜内皮细胞活性的正向调节作用,为建立旨在提高角膜内皮细胞培养质量的三维仿生培养系统提供理论依据;阐明病理性高眼压下角膜内皮细胞损伤的病理基础和调控环节,为青光眼治疗策略中的内皮细胞保护提供实验依据。 方法: 第一部分角膜内皮细胞体外常规培养 将带有兔角膜内皮细胞的后弹力层完整撕下,0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA联合酶化,纯化的角膜内皮细胞进行体外培养。倒置显微镜下观察细胞形态,神经元烯醇化酶抗体进行细胞表型鉴定, HE染色观察细胞形态结构,分析培养角膜内皮细胞的活性与纯度。 第二部分角膜内皮细胞正常压力仿生培养 设计并制作自动充压范围为0～75mmHg的压力维持培养装置,测定预设压力的维持时间,确定自动充压的时间点。将接种了传代角膜内皮细胞的培养板放入压力预设为2KP的压力维持培养装置中,进行持续培养。倒置显微镜定期观察细胞形态及生长规律, HE染色及扫描和透射电镜分析细胞结构的变化,茜素红-台盼兰联合染色和AnnexiV-PI流式细胞术分析细胞活性。 第三部分高眼压对角膜内皮细胞损伤机制的研究 通过体外仿生培养系统,模拟临床青光眼的病理过程,将压力分为压力急性增高组(50mmHg)、压力慢性增高组(30mmHg)、波动组(15mmHg~25 mmHg ~20 mmHg ~10 mmHg)、正常压力组(15mmHg)作为对照组。倒置显微镜定期观察细胞形态及生长规律, HE染色分析细胞结构的变化,茜素红-台盼兰联合染色和AnnexiV-PI流式细胞术分析细胞活性, RT-PCR分析Fas/FasL在压力作用下的表达规律,Western-blotting检测不同压力组凋亡相关蛋白BcL-2和P53的时空量化曲线,免疫荧光观察凋亡启动后细胞内Cytc的表达强度及范围。 结果: 1、后弹力层撕除联合酶消化法获得大量纯化的角膜内皮细胞,快速贴壁生长并增殖,体外培养3～4 d即融合成单层细胞,表达神经元烯醇化酶抗体阳性, HE染色及活性染色提示细胞功能良好。 2、生理压力环境培养下的角膜内皮细胞生长活性良好,细胞立体感强、外形扁平呈六边形,细胞间连接紧密,更接近机体生理状态下生长的内皮细胞。生理压力下未见明显的细胞凋亡现象。 3、高压环境下培养的角膜内皮细胞,增殖缓慢,胞体大而透明,胞浆内含较多的颗粒,细胞间隙增宽。随压力越高,培养时间的增长, AnniexV表达增强,凋亡细胞比例显著增加。 4、RT-PCR未检测到Fas/Fasl的表达,高压持续作用下凋亡相关蛋白P53的表达显著上调,Bcl-2表达则随之下降,使用抑制剂预处理的细胞,其蛋白P53的表达较未预处理的细胞明显下降,Bcl-2表达明显增加。高压组角膜内皮细胞胞浆中Cytc的阳性表达显著增加。 结论: 1.正常压力仿生培养环境,对角膜内皮细胞的功能有正向调节作用,诱导角膜内皮细胞骨架的改变,使其物理形态更接近体内的角膜内皮细胞,同时促进体外培养角膜内皮细胞之间连接功能的建立,为工程化角膜内皮移植膜的构建提供了新的环境模式诱导平台。 2.眼压的波动性与角膜内皮细胞的损伤之间存在相关性,高压力对角膜内皮细胞有损伤作用,导致细胞凋亡的发生,并且呈现时间-量效曲线。 3.压力调控下细胞凋亡启动途径是角膜内皮细胞Cytc从线粒体释放入胞浆,通过激活凋亡的内源性途径实现。 4. Caspase9可以作为青光眼高眼压对角膜内皮细胞损伤的药物干预靶点,为青光眼治疗策略中的内皮细胞保护提供实验依据。
【图文】：

立体感强，周围有后弹力层碎片。24h 后见大部分细胞已经贴壁，细胞形态不规则多角，胞浆丰富，核不明显，将后弹力层碎片吸出。第 2-3d 细胞生长活跃向四周扩展，形态不归则。可见部分细胞融合形成细胞岛（如图 2-2）。第4d 见大部分细胞融合，细胞多呈多边形，边界清楚，胞浆丰富，，核不明显，呈铺路石状，面积已达孔底的 80%-90% （如图 2-3 ）2.3.1.2 传代培养原代 RCE 接种在培养板内 3～4h 后部分开始贴壁,24h 后大部分细胞已经贴壁，角膜内皮细胞胞体饱满,胞浆丰富,形态不规则,以多边行为主，细胞生长与分裂十分旺盛，3～4d 细胞达密集状态（如图 2-4）。细胞传至 4-5 代后,细胞开始出现老化现象，细胞胞体透明度增加,胞体增大，隐约可见细胞胞核,细胞内颗粒增多，（如图 2-5）2.3.2 RCEC 的免疫学鉴定神经元烯醇化酶抗体表达阳性，细胞胞浆表现为棕黄色，细胞核呈蓝色，无角膜上皮细胞及基质细胞污染（如图 2-6）

立体感强，周围有后弹力层碎片。24h 后见大部分细胞已经贴壁，细胞形态不规则多角，胞浆丰富，核不明显，将后弹力层碎片吸出。第 2-3d 细胞生长活跃向四周扩展，形态不归则。可见部分细胞融合形成细胞岛（如图 2-2）。第4d 见大部分细胞融合，细胞多呈多边形，边界清楚，胞浆丰富，核不明显，呈铺路石状，面积已达孔底的 80%-90% （如图 2-3 ）2.3.1.2 传代培养原代 RCE 接种在培养板内 3～4h 后部分开始贴壁,24h 后大部分细胞已经贴壁，角膜内皮细胞胞体饱满,胞浆丰富,形态不规则,以多边行为主，细胞生长与分裂十分旺盛，3～4d 细胞达密集状态（如图 2-4）。细胞传至 4-5 代后,细胞开始出现老化现象，细胞胞体透明度增加,胞体增大，隐约可见细胞胞核,细胞内颗粒增多，（如图 2-5）2.3.2 RCEC 的免疫学鉴定神经元烯醇化酶抗体表达阳性，细胞胞浆表现为棕黄色，细胞核呈蓝色，无角膜上皮细胞及基质细胞污染（如图 2-6）
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R772.21

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本文编号：2573367