小胶质细胞失稳态在光损伤视网膜变性中的作用研究

发布时间：2020-02-02 20:13

【摘要】：以年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)、原发性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)等为代表的外层视网膜变性性疾病是目前世界范围内主要的致盲眼病之一,其共同的病理改变为光感受器细胞不可逆性的凋亡。此类疾病的分子病理机制及治疗是目前研究的难点。近年来小胶质细胞的作用逐渐受到重视。光感受器损伤后激活小胶质细胞,导致进一步神经元损伤已得到证实。但光感受器损伤和小胶质细胞激活之间的分子对话机制仍不清楚,阻止该过程成为从同一途径延缓视网膜变性发展的关键。研究提示趋化因子Fractalkine可能是二者功能对话的重要介质。本研究采用光损伤视网膜模型、体外光感受器和小胶质细胞共培养模式,研究Fractalkine及受体CX3CR1信号在光感受器损伤后的时空变化,着力于分析该信号的变化规律及与视网膜小胶质细胞激活、神经元凋亡之间潜在的关系,并深入探讨其调控小胶质细胞激活的细胞内信号途径,阐明神经元损伤和小胶质细胞激活之间的分子机制,为延缓视网膜变性疾病的进展开拓新治疗思路。第一部分 Fractalkine/CX3CR1在光损伤大鼠模型中的表达时空变化规律及与小胶质细胞和神经元关系的研究目的：探讨Fractalkine及其受体CX3CR1在光损伤大鼠模型中的表达时空变化规律,并着重分析比较其时空变化与神经元凋亡及小胶质细胞迁移活化之间的可能关系。方法：将SD大鼠置于光损伤箱中接受24h强度为25001ux的宽谱蓝光照射,制成Ⅰ型光损伤动物模型,选取光损伤后的2h、6h、1d、3d、5d、7d为观察检测时间点。采用HE (hematoxylin and eosin)染色观察不同时间节点光损伤大鼠外核层的厚度及感光细胞数目变化情况。采用免疫组化荧光观察视网膜病变不同阶段小胶质细胞的活化迁移及Fractalkine/CX3CR1的表达部位及表达量的变化,用原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测视网膜光感受器凋亡情况,利用Western blot、 Real Time-PCR检测Fractalkine/CX3CR1、炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白及mRNA表达变化情况,进一步从分子信号水平观察MAPK家族的表达变化情况。综合以上检测结果分析寻找Fractalkine/CX3CR1与光感受器凋亡、小胶质细胞迁移活化及炎症因子分泌之间的关系。结果：HE染色显示光损伤后大鼠视网膜出现进行性光感受器减少和外核层变薄,且光感受器内外节结构紊乱。免疫荧光显示光损伤后感光细胞层出现Fractalkine表达增多,与小胶质细胞活化迁移的位置较一致,其受体CX3CR1在视网膜内主要表达于小胶质细胞。Western blot、Real Time-PCR可见Fractalkine/CX3CR1蛋白和mRNA出现表达上调,分别在损伤后1d、3d达到表达高峰。UNEL结果显示光损伤后2h即出现明显的感光细胞凋亡并随着时间推移凋亡细胞数目增多,1d时达到凋亡高峰。观察发现炎症因子TNF-α、IL-1β以及MAPK家族中p-p38, p-p44/22和p-SAPK/JNK均出现了与上述指标相吻合的表达水平波动。结论：趋化因子Fractalkine及受体CX3CR1可能是视网膜感光细胞损伤和小胶质细胞激活之间的重要分子对话机制,MAPK家族可能参与了Fractalkine/CX3CR1调控小胶质细胞激活的细胞内信号途径的过程或者光诱导感光细胞凋亡的过程。第二部分 Fractalkine/CX3CR1对体外共培养体系光感受器损伤和小胶质细胞激活之间分子对话作用的研究目的：探讨损伤后的光感受器和视网膜小胶质细胞激活之间的交互对话信号,主要关注点是趋化因子Fractalkine及其受体CX3CR1在光损伤光感受器变性性疾病中的作用。方法：将SD大鼠视网膜原代培养的小胶质细胞与感光细胞系661W在transwell小室中进行共培养,并置于特制的细胞照光箱中接受5h宽谱蓝光照射制成细胞光损伤模型,选取光损伤后的6h、12h、24h、36h、48h为观察检测时间点。在共培养体系中预先加入CX3CR1中和性封闭抗体或膜结合形式Fractalkine或小分子可溶性Fractalkine作为不同的干预组。采用Elisa法检测可溶性小分子Fractalkine、炎症因子TNF-α和IL-1β的分泌情况,TUNEL法检测感光细胞系661W凋亡情况,通过趋化实验观察可溶性小分子Fractalkine对小胶质细胞迁移的作用。结果：蓝光损伤后70%-80%的感光细胞系661W出现了凋亡,与之共培养的小胶质细胞则出现了激活的形态学表现,由分支状变为阿米巴状,并且小分子Fractalkine和炎症因子在细胞上清液中的表达升高。与对照组相比,在CX3CR1中和性封闭抗体组出现了较多的感光细胞存活,加入外源性的膜结合形式Fractalkine和小分子可溶性Fractalkine分别表现出为减少感光细胞凋亡和促进小胶质细胞迁移的作用。结论：初步证实了蓝光损伤感光细胞系661W可导致Fractalkine裂解,并通过Fractalkine/CX3CR1途径激活小胶质细胞。而激活的小胶质细胞可释放炎症因子反过来加重感光细胞原有的损伤。对趋化因子Fractalkine及受体CX3CR1参与视网膜感光细胞损伤和小胶质细胞激活之间的分子对话的研究,为延缓视网膜变性疾病的进展开拓新治疗思路,进一步将研究Fractalkine/CX3CR1激活小胶质细胞的细胞内信号途径,为调控该信号通路、抑制小胶质细胞过度激活开辟新的治疗途径提供理论依据。
【图文】：

光损伤,外核层,视网膜,光感受器

从旦大学博士学位论文四实验结果(一）光损伤诱导光感受器变性调亡的情况根据实验设计，我们顺利将SD大鼠制成光损伤视网膜变性模型，从形态学角度分析了光感受器的存活情况，并用TUNEL法检测视网膜细胞调亡情况。结果显示SD大鼠经过24h光损伤后，在2h、6h、Id、3d、5d、7d七个时间点分别取光照组和对照组大鼠视网膜，，采用HE染色观察视网膜结构层次的变化，发现进行性光感受器减少和外核层变薄，且光感受器内外节结构紊乱（见图1A-E，箭头所示为外核层）。

小胶质细胞,情况,视网膜,光损伤

记的小胶质细胞只存在于内层视网膜，包括感光细胞层、内丛状层、内核层（见图3A)。光损伤以后，越来越多的小胶质细胞开始由视网膜内层向外层迁移，甚至到达视网膜下腔（见图3B)。另外，视网膜铺片免疫组化显示正常组视网膜小胶质细胞呈分支突起状（见图3C)，光损伤后的小胶质细胞呈阿米巴状（见图3D),小胶质细胞这些行为学和形态学的改变提示进入了激活状态，这与以往的相关报道较一致。Normal sd图3免疫焚光示小胶质细胞激活迁移情况。A正常视网膜小胶质细胞主要存在于内层视网膜。B光损伤后3d,大量小胶质细胞由视网膜内层向外层迁移。C-D视网膜铺片上小胶质细胞的形态也由静止状态的分支状变为活化状态的阿米巴状。(三）Fractalkine/CX3CR1在光损伤模型中的表达及变化情况通过对不同时间节点各组视网膜进行免疫组化检测，我们发现Fractalkine在正常视网膜中分布较为广泛，但是量较少，而光损伤后视网膜Fractalkine的表达出现显著上升，免疫组化显示表达升高的部位主要位于感光细胞层，6h即可观察到外节盘部位出现表达上调
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R774.13

【共引文献】