CREB在氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用及机制研究

发布时间：2020-02-07 07:35

【摘要】：第一部分RMVECs的培养与鉴定及RMVECs缺氧模型的建立目的：分离、培养、鉴定小鼠视网膜微血管内皮细胞(RMVECs),建立RMVECs缺氧模型,并评估该模型的有效性。方法：原代培养的视网膜微血管内皮细胞取材于C57BL/6J小鼠视网膜,用Ⅷ因子相关抗原进行细胞鉴定。3-6代小鼠视网膜微血管内皮细胞培养于厌氧袋中构建缺氧模型。缺氧时间设为0.5、1、2、3、12、24、48及72小时。血气分析各时间点细胞培养液的pO2, pCO2及pH,对该模型进行评估。结果：Ⅷ因子相关抗原法鉴定视网膜微血管内皮细胞阳性率为90%。当视网膜微血管内皮细胞在厌氧袋中培养2小时,血气分析结果显示p02为5.60Kpa, pC02为6.04Kpa,pH为7.07;当视网膜微血管内皮细胞在厌氧袋中培养大于2小时,血气分析结果显示p02为4.5Kpa, pCO2和pH无明显变化。结论：采用组织块贴壁法成功培养出小鼠RMVECs.厌氧袋培养RMVECs可以有效建立RMVECs的缺氧模型,该方法简单有效。第二部分CREB小干扰RNA对缺氧诱导的RMVECs增殖产生影响目的：应用RNA干扰技术使视网膜微血管内皮细胞中的CREB基因沉默,观察其对RMVECs增殖的影响并探讨可能的机制。方法：利用RNA干扰技术,设计构建针对CREB基因siRNA慢病毒载体,将此CREB特异性siRNA序列的慢病毒载体转染入RMVECs,同时设立空载对照。观察时间设为12、24、48、72、96h。转染效率通过荧光显微镜观察。实验分为四组：常氧组,缺氧模型组,缺氧+siRNA组,缺氧+空载体组。采用MTT法检测各组细胞增殖能力。应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)和免疫印迹法(Western Blot)检测各组不同时间点CREB、AKtmRNA及蛋白表达水平。结果：CREBsiRNA慢病毒表达载体转染缺氧诱导的RMVECs后,48小时可见少量绿色荧光蛋白,转染72h后表达荧光细胞逐渐增多、强度增强,96h开始下降。转染72h后转染效率为70%。实时荧光定量聚合酶链反应(Real-TimePCR)和免疫印迹法(Western Blot)均显示CREB-siRNA慢病毒载体能有效特异地降低RMVECs中CREB的表达。MTT法检测各组细胞增殖结果显示转染72小时后缺氧+siRNA组细胞增殖率明显低于其它3组(p0.05);缺氧模型组与缺氧+空载体组无明显差异(p0.05)。转染72小时后缺氧+siRNA组CREB、AKtmRNA及蛋白表达水平明显低于缺氧模型组及缺氧+空载体组(p0.05);缺氧模型组与缺氧+空载体组CREB、AKtmRNA水平无明显差异(p0.05)。结论：CREB靶向siRNA在体外能特异性及有效地抑制缺氧诱导的RMVECs中CREBmRNA及蛋白的表达,最佳转染时间为转染后72小时。在缺氧环境下培养的RMVECs中,CREB沉默可以抑制缺氧诱导的RMVECs增殖并诱导凋亡,这种作用可能与抑制PI3K/AKt信号通路的表达有关。第三部分CREB在氧诱导视网膜病变小鼠模型的表达研究目的：通过氧环境的变化诱导小鼠产生新生血管,建立氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy, OIR)模型。探讨CREB在视网膜新生血管形成过程中的表达及其意义。方法：将186只7日龄C57BL/6J小鼠随机分成正常对照组和诱导模型组。正常对照组置于正常环境温度下饲养；诱导模型组置于氧浓度为(75±2)%的密闭环境中饲养5天后转移至正常环境温度下再饲养5天,建立OR模型。取两组17日龄小鼠眼球做石蜡包埋切片,行HE染色并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目；取两组17日龄小鼠应用视网膜荧光血管造影观察视网膜血管的形态学变化和新生血管的形成。分别于7日龄、9日龄、12日龄、14日龄、17日龄和21日龄将两组小鼠处死,用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)和免疫印迹法(Western Blot)分别检测CREB在正常对照组视网膜和诱导模型组视网膜新生血管形成过程中的表达情况。结果：视网膜荧光血管造影铺片结果显示在诱导模型组小鼠视网膜中有大量新生血管生成,其结构和分布紊乱;HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目诱导模型组与正常对照组相比,数量明显增加且差异具有显著性(P0.01)。Real-Time PCI法和Western Blot法显示在诱导模型组视网膜新生血管形成过程中CREB的mRNA和蛋白表达水平均明显升高,与正常对照组的差异均具有显著性(P0.05;p0.05),并且CREB的表达变化与视网膜新生血管的形成呈正相关的趋势。结论：研究结果表明在OIR小鼠模型中CREB呈明显高表达,并且CREB的表达变化与视网膜新生血管的形成呈正相关的趋势。CREB有可能是治疗视网膜新生血管性疾病的新靶点。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R774.1

【参考文献】