糖尿病大鼠玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞的研究

发布时间：2020-02-16 17:24

【摘要】： 目的研究糖尿病大鼠玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUMSCs)对视网膜的影响。方法本课题分为两部分：第一部分采用常规实验室方法无菌条件下收集剖宫产新生儿脐带,酶消化法获取hUMSCs,进行培养。用流式细胞仪检测hUMSCs的表面标志物。第二部分78只成年健康雄性SD大鼠随机分为糖尿病组和正常对照组两组,在链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的糖尿病模型建立6W后,左眼玻璃体腔移植PKH-26标记的2μl3×104hUMSCs/DMEM-F12设为实验组,右眼玻璃体腔注射等量的DMEM-F12设为对照组,根据处死动物的时间不同分为U1D1、U2D2、U4D4组,于相应的时间点深度麻醉处死动物,取眼球进行观察。荧光显微镜下观察移植细胞在玻璃体腔中的存活、迁移和整合至宿主视网膜情况。HE染色比较不同处理组视网膜结构的变化,且分别对比不同处理组视网膜内核层(inner nuclear layer, INL)和外核层(outer nuclear layer, ONL)的厚度。荧光免疫组化观察视网膜组织中GFAP蛋白的表达。Western-blot和real time-PCR分别检测不同处理组中GFAP、NSE、Rhodopsin蛋白和mRNA在视网膜的表达。结果 1.从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长；细胞强表达CD29、CD105(SH2)、CD73(SH3),不表达CD14、CD34、CD31、CD45、HLA-DR,阳性细胞超过95%以上,细胞纯度较高。 2.移植玻璃体腔的hUMSCs在玻璃体腔发生迁移,主要沿内界膜分布,仅少部分整合至神经节细胞层。糖尿病大鼠与正常对照组大鼠视网膜内核层厚度比较,差异具有显著性(P0.05)；U4与D4内核层厚度对比,差异具有显著性(P0.05)；U1和D1以及U2和D2内核层厚度对比,差异均不具有显著性意义(P0.05)。外核层厚度的对比在各组间差异均不具有显著性意义(P0.05)。 3.糖尿病6W大鼠视网膜组织结构内界膜结构不明显,神经纤维层(nerve fiber layer, NFL)变薄,神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)数目减少,细胞边界欠清；INL和ONL细胞边界欠清,细胞核色泽加深,INL细胞稀疏,密度减少,ONL内侧细胞密集,外侧部分细胞相对密度减少；余未见明显病理改变。糖尿病大鼠玻璃体腔移植hUMSCs 1W组(U1)和对照1W组(D1)组织结构无明显差异；U2和D2组视网膜组织结构变化同1W处理组对比,RGCs数量有不同程度减少,D2组较U2组INL与ONL均变薄；U4组与D4组对比RGCs细胞数量稀疏,细胞核深染,D4组较U4组NFL扁平；INL变薄且结构紊乱；ONL排列较乱。 4.免疫荧光染色示糖尿病大鼠视网膜中GFAP的表达要高于正常对照组；在U1和D1组的GFAP表达对比,U1组中的表达量强于D1；U2和D2组中对比GFAP的表达,D2组中的表达量强于U2；U4和D4组中对比GFAP的表达,D4组中的GFAP表达要强。 5.糖尿病6W组视网膜GFAP、NSE以及Rhodopsin mRNA的表达,与正常对照组相比差异有显著性(P0.05)；U1与D1组对比,视网膜GFAP、NSE以及Rhodopsin mRNA的表达无显著差异(P0.05); GFAP和Rhodopsin mRNA的表达在U2与D2以及U4与D4组间对比,差异有显著性(P0.05),U4与D4组对比NSE表达与对照组差异有显著性(P0.05)。视网膜GFAP蛋白在正常组中为低表达,随糖尿病的进展而表达增加；NSE和Rhodopsin则相反；玻璃体腔移植早期对比同期对照,蛋白表达差异不明显；4W可见明显差异。结论1.STZ诱导的糖尿病大鼠,是模拟人非增殖期糖尿病视网膜病变的一种可靠的动物模型。 2. hUMSCs移植到糖尿病大鼠玻璃体腔后能够存活、迁移并整合到受损的视网膜上 3.糖尿病大鼠玻璃体腔移植hUMSCs,推断其可以诱导视网膜出现相关基因和蛋白的表达,这可能对视网膜的损伤起到保护作用。
【图文】：

贴壁细胞,漩涡,成纤维样细胞,细胞形态

少量为多突起的星形样细胞。细胞折光度好，核仁明显，胞体较BMSCs稍宽大。每个细胞集落细胞数达到上百个或数百个。细胞形态渐变为均一的纺锤形(图2)。成纤维样细胞增殖能力旺盛，至Zw左右可达到80%融合，脐静脉内皮细胞生长则受到明显抑制。用0.25%胰酶消化，传代后可得到纯化的成纤维样细胞。传代后的细胞形态无明显变化，性质稳定(图3)。图2原代达到融合的贴壁细胞，，星漩涡状排列Zoox图3第二代贴壁细胞ZooX 1.2.2免疫表型的鉴定对第3代UCMSCs行流式细胞学的检测。表明hUMSCs强烈表达CD29、CD105(SHZ)、CD73(SH3)，不表达CD14、CD34、CD31、CD45、HLA一DR(图3)。CD29属于整合素家族， CD105(SHZ)、Cn73(SH3)是间充质相关抗原

干细胞,微环境

1.3讨论1.3.1间充质干细胞的概述IbJ充质干细胞 (mesenchymalstemeells，MSCs)通常是指来源于中髓或其他组织中分离到的成体干细胞，在体外具有多向分化潜能，中胚层组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌)Jw、脂肪及基质细胞等增殖可在适宜条件下向内胚层的肝卵圆性细胞、外胚层的神经细胞等非分化【’，2]，是造血微环境中的一种重要细胞成分，而且免疫原性弱，质干细胞不仅能够向多种组织和细胞分化，而且易于分离、培养、扩外源基因的导入和表达，在体外长期培养的过程中始终保持多向分遗传背景相当稳定。是组织工程理想的种子细胞来源I3.“}。目前认为干细胞进入微环境后对分化信号的反应受周围正在进行胞影响，并对新的微环境中的调节信号做出反应，可称之为“环境诱细胞对环境信号的反应能力随时间而变化，反应强弱取决于细胞表
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R774.1

【参考文献】