真菌感染小鼠角膜过程中菌丝和主要炎症细胞动态变化的研究

发布时间：2020-03-12 14:14

【摘要】：目的由于真菌性角膜炎的具体发病机制尚不清楚,尽管不断更新的实验室诊断方法和大量真菌性角膜炎药敏实验的资料为临床提供了相关信息,但真菌性角膜炎的临床治疗仍然靠最常见的经验进行,以致较多的患者最终丧失视力,甚至眼球的摘除。真菌性角膜炎现已成为治疗效果差、致盲率高的眼科常见病。为此,本实验建立一种模拟临床上丝状真菌感染人角膜模式的C57BL/6纯系小鼠真菌性角膜炎模型,裂隙灯观察真菌感染角膜后角膜组织损伤的临床表现,常规石蜡切片观察角膜组织的病理形态学改变,角膜活体共焦显微镜动态观察真菌性角膜炎动物模型影像学上的组织病理学变化,激光共聚焦扫描显微镜对真菌感染小鼠角膜过程中菌丝和主要炎症细胞的动态变化进行研究,进而推动真菌性角膜炎发病机制研究的步伐,为临床上更加积极有效地防治真菌性角膜炎提供理论和实验基础。方法 1、动物模型建立选择国内最常见的致病菌种腐皮镰刀菌和黄曲霉菌,采用C57BL/6纯系小鼠右眼行真菌接种,左眼为手术对照组。常规消毒后眼科手术显微镜下行角膜划痕法接种真菌,深度为破坏角膜上皮到达浅基质层,对照眼同样方式划痕接种生理盐水。裂隙灯显微镜下观察角膜感染情况并拍照记录,分别于接种后第1,3,5,7,14d各时相对角膜组织病变进行临床评分,同时行模型眼和对照眼角膜刮片后涂片染色和真菌培养,并对各种病原学检测结果进行对比分析。 2、组织病理学检测分别于接种后第1,3,5,7,14d各时相摘取小鼠眼球,置于福尔马林固定24h,常规石蜡切片,行PAS染色,光学显微镜下对不同时间点角膜组织的破坏和菌丝的形态特点进行分析。 3、活体角膜共焦显微镜研究真菌感染小鼠模型眼和对照眼角膜早期(造模后6h、8h、12h、1d)、中期(2d、3d、5d)、后期(7d、14d),分别行角膜中央感染区及病灶周边部的角膜共焦显微镜检查,对病变角膜浸润病灶的中心区及周边区选择5个位点进行三维扫描。分别于接种后第1,3d时间点,每组随机取12只小鼠常规角膜刮片后染色镜检和真菌培养。 4、全角膜平铺片的激光共聚焦扫描显微镜研究分别于接种后第12h,1,3,5,7d各时相眼球赤道穿透性切取带角膜缘的整个眼前节,于新鲜配置的PBS液中剔除虹膜,置1%多聚甲醛-PBS中固定30min,0.2%Triton X-100的2%BSA液透膜15min;分别使用CFW荧光染料、标记中性粒细胞荧光抗体、标记淋巴细胞抗体于4℃避光孵育过夜,放射状切开平铺于载玻片上,使用溶有DAPI染料的胶水固定过夜。在激光共聚焦扫描显微镜下观察真菌的生长方式以及对真菌进行定量分析,观察真菌感染角膜过程中的炎症细胞表达的变化。 5、真菌性角膜炎临床早期诊断的应用研究临床疑似真菌性角膜炎患者165例行角膜刮片,获取的角膜刮取物用于角膜涂片镜检和真菌培养。同一病人一部分角膜刮取物均匀地涂在两张已处理过的载玻片中央,其中一张角膜涂片先行KOH湿片,在光镜下观察后行CFW荧光染色；同一病人的另外一张角膜涂片,先行Giemsa染液染色,光镜下观察后行CFW荧光染色。 6、统计学处理实验数据采用SPSS13.0软件包进行统计学处理,分别采用Kraskal-willis H检验、单因素LSD t检验、Mann-Whitney U检验、卡方(chi-square test)检验、趋势卡方检验等统计学方法分析,P0.05为差异有统计学意义。结果 1、模型眼角膜刮片染色与真菌培养两种真菌性角膜炎病变过程的早期(1d),中期(3d)CFW荧光染色的阳性率显著高于KOH湿片和Giemsa染色的阳性率,差异有统计学差异(镰刀组1dCFW vs KOH, P=0.047;ldCFW vs Giemsa, P=0.047; 3d CFW vs KOH, P=0.007; 3dCFW vs Giemsa, P=0.001;黄曲组1dCFW vs KOH, P=0.047; 1dCFW vs Giemsa, P=0.007; 3d CFW vs KOH, P=0.047; 3dCFW vs Giemsa, P=0.001),但与真菌培养的阳性率相比,无统计学差异(p0.05)。在病变的后期,各种检查方法很少能探测到真菌的存在。 2、真菌感染角膜病变特征两种真菌感染角膜后病变的发展过程具有一定差异,在2-5d是病变的高峰期,7d后病变逐步减轻。两种真菌感染角膜后病程约2w,腐皮镰刀菌组病变过程相对较平稳,黄曲霉菌组病变发展快且严重。黄曲模型眼在1,3,5,7,14d时间点病变的临床评分组内比较,差异有统计学意义(P0.05),黄曲霉菌角膜炎第3天及第4天临床评分明显高于腐皮镰刀菌角膜炎,差异有统计学意义(p0.05)。 3、角膜组织病理学检查接种后第1 d可见划痕处角膜上皮层部分或完全缺损,缺损面细胞水肿严重,呈水泡样变,基质水肿,两种真菌菌丝主要分布于浅、中基质层；第3d可见上皮缺损面积缩小,角膜基质水肿严重,基质层胶原纤维排列紊乱,菌丝分布于角膜全层,镰刀菌丝体较粗长,曲霉菌丝体短小,部分病变角膜在未穿孔前已有菌丝或孢子穿透角膜内皮进入前房；第5天可见部分小鼠角膜上皮层局限性增生修复,部分仍可见溃疡灶,基质严重水肿,偶见菌丝生长,菌丝量明显少于第3天,并见菌丝体缩小,新生血管长入。接种后第7天,角膜全层未见菌丝,较多新生血管长入角膜基质。 4、角膜共焦显微镜诊断的敏感性两种真菌性角膜炎动物模型在造模后的第1,3d时间点,以真菌培养为标准,共焦显微镜诊断的阳性率与CFW荧光染色的阳性率相比较,无明显的统计学差异(p0.05);在第5d时间点,真菌菌丝的检出率较低；第7d后真菌菌丝检出率为0。 5、菌丝的影像学特征激光共焦显微镜图像显示：在感染早期,腐皮镰刀菌表现为短线状或蚯蚓状结构,中期为长而支挺、分支极少的长线状结构,病变部位角膜形态结构破坏明显；黄曲霉菌在早期为短小、弯曲的蠕虫状结构,中期为走行更加弯曲,分支较多呈树枝状或簇状结构,病变部位角膜形态结构消失。后期均未真菌结构。 6、菌丝在模型眼角膜中的动态变化镰刀菌首先在病变部位粘附,然后生长繁殖,真菌感染后12h,真菌侵入的层次局限为浅、中基质层,在1d时,真菌已分布角膜全层。在接种点周围,菌丝在浅、中、深基质生长方式有明显的层次性。真菌的菌丝量在3d达到峰值。5d后突然减少消失。黄曲霉菌在病变部位粘附的时间相对较晚,但其生长繁殖速度较快,真菌感染后12h,真菌侵入的层次已有菌丝在深基质层,在1d时,真菌已分布角膜全层,其生长方式丝纵横交错,交织成网。真菌的菌丝量在2d达到峰值。在3d时,真菌的菌丝已有所减少,5d后真菌菌丝较少或已消失。黄曲霉菌第1天及第2天菌丝的含量明显高于镰刀菌,但在第3天低于镰刀菌,差异均有统计学意义(1d,t=-8.657,p=0.000；2d,t=-16.952,p=0.000；3d,t=4.543,p=0.000),在12h与5d时间点,两组间差异均无统计学意义(p0.05)。 7、模型眼角膜组织中性粒细胞表达的变化正常小鼠角膜巩膜缘区域有少量中性粒细胞的散在分布。模型对照组鼠眼术后12h角膜上9个区域里中性粒细胞的数量达到峰值,随后中性粒细胞的数量逐渐减少。。两种真菌性角膜炎模型眼12h角膜上各个区域里中性粒细胞的数量都达到第一个峰值,3d时角膜里中性粒细胞的数量达到了第二个峰值,5d后中性粒细胞数量逐步减少(图3-22,3-23)。两组模型眼组内不同时间点中性粒细胞的数量相比有明显统计学差异(镰刀组F=311.858,p=0.000；黄曲组F=570.811,p=0.000)。在12h,1d,3d,7d时间点两组中性粒细胞的数量相比有明显的统计学差异(12h,t=-3.519,p=0.006；1d,t=-4.659,p=0.001；3d,t=-5.338,p=0.000；7d,t=4.335,p=0.001)。 8、模型眼角膜组织淋巴细胞表达的变化正常小鼠角膜巩膜缘区域有少量淋巴细胞的散在分布。模型对照组鼠眼术后12h角膜上淋巴细胞的数量开始增多,24h淋巴细胞的数量到达峰值,随后逐渐减少。镰刀菌模型5d眼角膜里淋巴细胞的数量达到峰值,随后其数量逐步减少。在病程的中期和后期,黄曲霉菌模型眼角膜里淋巴细胞的数量与镰刀菌淋巴细胞数量相比,有明显的统计学差异(3d,t=-10.217,p=0.000；5d,t=-22.704,p=0.000；7d,t=-7.444,p=0.000)。 9、临床角膜刮片染色与真菌培养以真菌培养阳性作为诊断真菌性角膜的金标准,在同一张角膜涂片KOH和CFW染色的敏感性分别为81.0%和96.6%,在同一张角膜涂片Giemsa和CFW染色的敏感性为39.7%和98.3%,此外,Giemsa检测到23例细菌感染,其中6例为混合感染。CFW染色的敏感性显著高于KOH和Giemsa染色。结论 1、我们在宿主正常免疫状态下,采用角膜划痕法成功建立了模拟临床真菌性角膜炎自然感染过程的动物模型。为推动真菌性角膜炎的基础和临床应用研究奠定了基础。 2、真菌感染角膜的病变过程历经发生、发展、转归三个阶段,即早、中、晚三期。不同菌种感染角膜的病变严重程度各有差异,中期是决定真菌性角膜炎预后的关键时间窗。 3、CFW荧光染色简单、快捷、敏感性高、特异性强。活体角膜共焦显微镜能够实时动态监控真菌的变化,且敏感性高、特异性强。两者均是实验室判定真菌性角膜炎动物模型的好方法。 4、不同菌种感染所致真菌性角膜炎激光共焦显微镜下菌丝有不同的影像学特点,且同一菌种不同时期在角膜组织中菌丝形态也有较大差异。为角膜共焦显微镜用于真菌性角膜炎的基础研究奠定了坚实基础,为临床上真菌性角膜炎的共焦显微镜鉴别诊断提供影像学资料。 5、应用激光共聚焦扫描显微镜能够对全角膜真菌信息准确的定性定量观察。黄曲霉菌菌丝较细,多密集分布,生长繁殖较快,生长方式杂乱无章。镰刀菌菌丝较粗,生长繁殖相对较慢,其生长方式有明显的层次性。 6、应用激光共聚焦扫描显微镜能够对全角膜炎症细胞的信息进行准确定性定量观察。早期和中前期浸润、募集的中性粒细胞对真菌的裂解、吞噬起主要作用,中后期浸润、募集的中性粒细胞对角膜组织则主要起到破坏作用。淋巴细胞的浸润募集较中性粒细胞出现晚,其峰值出现在中后期,因此,淋巴细胞在后期角膜病变中也起到重要作用。 7、Giemsa与CFW联合染色是临床诊断疑似真菌性角膜炎的较理想的方法,该联合染色不但灵敏度高,而且还可以识别细菌感染或混合感染,并能提供细胞病理学信息。是一个值得推广的临床早期诊断方法。
【图文】：

区域图,平铺,炎症细胞,抗体

*PE标记的抗小鼠CD31抗体(标记血管内皮抗体)3.2.9炎症细胞计数角膜组织中炎症细胞记数方法【”一’2】:如图3一1所示，将染色后的角膜放射状切开后平铺于载玻片上，使用了9个4OX物镜视野囊括整个角膜直径以确定收集数据的给定区域。每一视野的组织直径为 0.53mm。角巩缘区包括角巩缘血管和两边的无血管角膜区和巩膜区。以0，，1，2，3，4号共五个区域内的炎症细胞数之和代表一个角膜组织内的细胞数。万不、一卜合认时，、“己、~价、、一减可’”气_产二.艾J.丫、J矛月忿又豆少图3一1全角膜平铺片分?
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R772.21

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