姜黄素诱导喉癌Hep2细胞凋亡的作用机制研究

发布时间：2020-03-19 08:32

【摘要】：第一部分姜黄素诱导hep2细胞凋亡进程中死亡受体作用机制的实验研究目的:我们在预实验中已经证实姜黄素能诱导人类喉癌hep2细胞的凋亡,本实验拟证实姜黄素是否通过细胞凋亡外源性途径之一的TRAIL信号通道的死亡受体起作用。方法:通过RT-PCR检测TRAIL在hep2细胞中的表达,运用western blot检测姜黄素诱导凋亡前、后hep2细胞内死亡受体DR4及死亡诱骗受体Dc R1和Dc R2的表达的变化,流式细胞仪Annexin-V细胞凋亡检测法检测TRAIL对hep2细胞调亡的影响。结果:TRAIL在hep2细胞中的有明显表达(退火温度55℃时无表达)。随着姜黄素诱导时间增加,hep2细胞凋亡不断增多,但hep2细胞内死亡受体DR4及死亡诱骗受体Dc R1和Dc R2的表达无明显变化;用50nmol/L的TRAIL分别作用12h、24h、48h的hep2细胞与未经处理的对照组hep2细胞镜下观察均无明显细胞凋亡,流式细胞仪检测结果亦显示50nmol/L的TRAIL作用12h、24h、48h对hep2细胞凋亡无明显影响结论:通过本研究,发现人类喉癌hep2细胞为TRAIL抵抗细胞系,姜黄素能有效诱导其凋亡,但在凋亡诱导进程中,TRAIL信号通道的相关受体表达无明显变化,姜黄素可能通过其他凋亡途径诱导hep2细胞凋亡。第二部分人喉鳞状细胞癌Hep2细胞线粒体DNA缺失对凋亡的影响背景与目的:建立人喉鳞状细胞癌Hep2细胞的无线粒体DNA(ρ0)细胞,探讨人喉鳞状细胞癌线粒体与凋亡的关系.方法:在细胞培养液中加50ng/ml EB、100ug/ml丙酮酸钠、50ug/ml尿嘧啶进行连续传代培养至获得完全缺失mt DNA的细胞(ρ0细胞);用实时定量PCR技术检测EB处理后30天的人喉鳞状细胞癌细胞mt DNA的拷贝数;流式细胞仪检测EB处理4天、8天、12天的hep2细胞经姜黄素诱导凋亡后的细胞凋亡情况。结果:成功建立了人喉鳞状细胞癌Hep2细胞的无线粒体DNA(ρ0)细胞,经实时定量PCR检测,EB刺激30天后ρ0-hep2细胞内mt DNA的拷贝数为零;随着细胞分裂mt DNA的不断丢失,姜黄素诱导细胞凋亡率逐渐减少。结论:mt DNA在诱导细胞凋亡中起着一定调控作用。第三部分姜黄素促进ROS触发hep2凋亡机制的研究背景与目的:目前对癌症的研究越来越深入,针对癌症的药物也越来越广泛,但是仍然无法完全治愈癌症。本研究旨在利用人喉鳞状细胞癌hep2细胞,深入研究姜黄素在治疗癌症方面的作用机制,为临床治疗癌症提供实验依据。方法:建立mtDNA缺陷型细胞系,利用实时定量RT-PCR检测ρ0-hep2细胞中的mt DNA的表达;荧光酶标仪检测姜黄素诱导凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2细胞和正常hep2细胞内的活性氧自由基(ROS);以JC-1为探针染色法检测姜黄素诱导凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2细胞和正常hep2细胞内细胞线粒体膜电位(△Ψm);紫外分光光度计检测姜黄素诱导凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2细胞和正常hep2细胞内线粒体通透性(MPTP);Western Blot检测姜黄素诱导凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2细胞和正常hep2细胞中Cyto C的定位;酶标仪检测姜黄素诱导凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2细胞和正常hep2细胞内caspase 9活性;流式细胞仪检测姜黄素诱导凋亡后mt DNA缺陷的ρ0-hep2细胞和正常hep2细胞细胞凋亡情况。结果:线粒体缺陷(ρ0)hep2细胞比正常hep2细胞对姜黄素有更多的抵抗性;姜黄素处理后,mt DNA缺陷型hep2细胞产生的ROS产量相比较少;MPTP、线粒体膜电位、细胞色素C以及caspase9活性检测等实验证明,姜黄素诱导细胞后,细胞发生凋亡。结论:姜黄素通过调节ROS含量诱导细胞凋亡。
【图文】：

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文三、实验结果（一）、RT-PCR 检测 TRAIL 在 hep2 细胞中的表达情况为了明确 TRAIL（分子量 391bp）在 hep2 细胞中的表达情况，，我们采用 RT-PCR 进行检测。分别选用 5 个不同的退火温度（49℃/52℃/55℃/58℃/61℃ ）进行扩增，其相应扩增产物 cDNA 和 mRNA 在琼脂糖凝胶中电泳结果（Figure.1.1）表明 TRAIL 在 hep2 细胞中的有明显表达(退火温度 55℃时无表达)。mRNA 电泳阴性结果排除了扩增产物 cDNA 中基因组 DNA 污染。

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文为了检测姜黄素诱导凋亡后细胞内死亡受体 DR4 的表达情况，我收集姜黄素作用不同时间长度（1h、3h、6h、12h、24h）后的 hep2 细采用 western blot 对细胞内死亡受体 DR4 进行定位检测。结果表明随诱导时间增加 hep2 细胞凋亡不断增多，hep2 细胞内死亡受体 DR4 的达无明显变化（Figure.1.2）。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.65

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本文编号：2589983