真菌性角膜炎中Dectin-1对IL-1β生成和细胞凋亡的影响

发布时间：2020-04-09 01:50

【摘要】：目的:研究在烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus,AF)性角膜炎中JNK的磷酸化在Dectin-1介导的IL-1β生成中的作用以及Dectin-1对细胞凋亡的影响。方法:1.采用基质内注射的方法建立12h、1d、2d小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型,采用PCR、Western Bolt对Dectin-1和IL-1β的表达进行定量检测,采用免疫荧光对Dectin-1的蛋白表达进行定位检测。2.Dectin-1 siRNA对小鼠角膜进行预处理,建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型,裂隙灯下观察小鼠角膜炎症反应情况并记录临床评分,PCR或Western Bolt检测Dectin-1、JNK、p-JNK、IL-1β表达。3.JNK抑制剂SP600125对小鼠角膜和THP-1巨噬细胞进行预处理,建立烟曲霉菌感染模型之后,PCR、Western Bolt对IL-1β的表达进行检测。4.Dectin-1 siRNA对小鼠角膜进行预处理,建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型。PCR、Western Bolt对Bcl-2、Bax、细胞色素c(cytochrome-c,cyt-c)、caspase-8、caspase-9、caspase-3进行检测。结果:1.与正常对照组相比,Dectin-1 mRNA在烟曲霉菌感染小鼠角膜12h(p0.001)、1d(p0.001)、2d(p0.001)后表达明显升高,Dectin-1蛋白在烟曲霉菌感染小鼠角膜12h(p0.05)、1d(p0.001)、2d(p0.001)后表达明显升高。IL-1βmRNA在烟曲霉菌感染小鼠角膜12h(p0.001)、1d(p0.001)、2d(p0.001)后表达明显升高。IL-1β蛋白在烟曲霉菌感染小鼠角膜12h(p0.001)、1d(p0.001)、2d(p0.001)后表达逐渐升高。2.Dectin-1 siRNA对小鼠角膜进行预处理,建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型后,与对照siRNA+AF组相比,Dectin-1 siRNA+AF组小鼠角膜炎症反应减轻,临床评分降低(p0.05),JNK的磷酸化减少(p0.001),IL-1β的表达在mRNA(p0.001)和蛋白(p0.001)水平上显著降低。3.SP600125预处理小鼠角膜和THP-1巨噬细胞后建立烟曲霉菌感染模型。在动物模型中,SP600125+AF组与DMSO+AF组相比,IL-1β在mRNA(p0.001)和蛋白(p0.001)水平上表达明显降低。在细胞模型中,SP600125+AF组与DMSO+AF组相比,IL-1β在mRNA(p0.001)和蛋白(p0.001)水平上表达明显降低。4.Dectin-1 si RNA对小鼠角膜进行预处理,建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型后,Dectin-1 siRNA+AF组与对照siRNA+AF组相比,Dectin-1干扰并未明显影响caspase-8 mRNA表达(P0.05)和cleaved-caspase-8蛋白表达(P0.05),差异无统计学意义;Bcl-2在mRNA(p0.001)和蛋白(p0.001)水平上表达下降;而Bax(p0.001)、cyt-c(p0.05)、caspase-9(p0.001)、caspase-3(p0.001)在mRNA水平上的表达上升,Bax(p0.001)、cyt-c(p0.001)、cleaved-caspase-9(p0.001)、cleaved-caspase-3(p0.001)在蛋白水平上的表达上升。结论:小鼠烟曲霉菌性角膜炎中Dectin-1调控JNK的磷酸化和IL-1β的产生,磷酸化的JNK诱导IL-1β的生成。Dectin-1通过线粒体途径抑制小鼠烟曲霉菌性角膜炎中细胞的凋亡。
【图文】：

形态图,烟曲霉菌,分生孢子,菌丝

结果结果2.1 烟曲霉菌菌丝及分生孢子形态观察将烟曲霉菌接种于 Sabouroud 固体培养基中，再置于 28℃培养箱培养 1-2 天后可见白色真菌菌落形成，呈棉花样。随着真菌菌落的不断生长以及分生孢子的不断产生，培养基中的烟曲霉菌呈灰绿色，粉末状（图 1.A）。收集培养 2-3 天的烟曲霉菌的分生孢子之后用 PBS 涂片镜检，可见烟曲霉菌分生孢子呈球形，布满整个视野（图 1.B）。

照片,烟曲霉菌,角膜炎,小鼠

图 2.（A-H）小鼠烟曲霉菌性角膜炎中 Dectin-1 和 IL-1β的表达情况。（A）和（C）为小鼠角膜感染烟曲霉菌后 Dectin-1 mRNA 和蛋白的表达情况；（B）和（D）为 IL-1β的表达情况；（E-H）是对 Dectin-1 进行免疫荧光染色，红色的代表 Dectin-1，蓝色的代表 DAPI。2.3 干扰 Dectin-1 后可减轻小鼠烟曲霉菌性角膜炎炎症反应为了确定 Dectin-1 对小鼠烟曲霉菌性角膜炎炎症反应的影响，我们用 Dectin-1siRNA 特异性地对小鼠角膜中 Dectin-1 进行干扰，并通过临床评分和裂隙灯显微镜检查证实了特异性干扰了 Dectin-1 之后可减轻小鼠烟曲霉菌性角膜炎炎症反应。角膜照片显示，与对照 siRNA + AF 组（图 3.A）相比，Dectin-1 siRNA + AF 组（图3.B）的小鼠角膜感染较轻，角膜浸润灶较小，角膜溃疡的面积较小，溃疡深度较浅。两组间临床评分的结果也显示出显著性统计学差异（图 3.C），，与裂隙灯下所见一致，Dectin-1 siRNA 干预组的临床评分较 siRNA 对照组明显降低。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R772.21

【参考文献】