GRh2对角膜新生血管的抑制作用和机制研究

发布时间：2020-04-25 02:14

【摘要】：角膜新生血管(Corneal neovascularization,CoNV)可由缺氧、炎症等多种因素刺激形成,严重危害患者视力。其中,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)水平的提高是CoNV生成的关键。因此,抑制VEGF的表达对于治疗该疾病具有重要作用。人参皂苷Rh2(Ginsenoside Rh2,GRh2)是从名贵药材人参中提取的活性很高的药物成分。既往研究证实GRh2具有显著的抗癌活性,但其能否抑制VEGF诱导的CoNV尚未有研究报道。目的:本研究旨在探讨GRh2对VEGF诱导的CoNV的抑制作用及相关机制。方法:(1)采用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)作为研究对象进行体外培养,给予不同浓度GRh2(0.25-250μM)处理细胞,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)法检测细胞活性。细胞先给予1μM、10μM GRh2预处理30分钟,随后予VEGF(10ng/mL),MTT法、BrdU掺入实验、[H~3]胸苷掺入实验和Ki-67免疫荧光染色检测细胞增殖能力;划痕试验和迁移实验检测细胞迁移能力;成管实验检测细胞成管能力。(2)选取HUVECs细胞进行培养,给予相关刺激后,Western Blot法检测GRh2对VEGFR2信号通路和其下游ERK-MAPK和PI3K-AKT信号通路中相关蛋白表达的影响;免疫共沉淀(Co-IP)法检测检测GRh2对VEGFR2-Gab1结合及Gab1-p85结合、Gab1-SHP2结合的影响;检测GRh2对衔接蛋白(Gab1,SHP2和p85)表达的影响。(3)选取HUVECs细胞进行培养,短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体敲低HUVECs中衔接蛋白Gab1的表达,随后给予VEGF刺激,Western Blot法检测ERK-MAPK和PI3K-AKT信号通路中相关蛋白表达的改变;MTT法、BrdU ELISA分析和迁移实验检测Gab1的敲低对细胞增殖和迁移的影响。(4)构建碱烧伤小鼠模型,予以GRh2滴眼液治疗,通过显微裂隙灯观察各组小鼠角膜新生血管生长情况;HE染色法观察角膜组织中炎症细胞浸润和新生血管生长情况;qRT-PCR检测各组小鼠角膜中IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF、MPP-9等mRNA表达情况。结果:(1)在体外,GRh2明显抑制了VEGF诱导的HUVECs细胞的增殖、迁移和成管。(2)GRh2明显抑制了ERK-MAPK和PI3K-AKT信号通路中相关蛋白的磷酸化,并通过抑制VEGFR2与下游衔接蛋白Gab1等蛋白的结合抑制了VEGF信号通路。(3)干扰HUVECs中Gab1的表达明显抑制了ERK-MAPK和PI3K-AKT信号通路中相关蛋白的磷酸化,抑制了VEGF诱导的细胞增殖和迁移。干扰Gab1表达的HUVECs,加入GRh2不能进一步抑制其增殖和迁移。(4)GRh2明显抑制了碱烧伤小鼠角膜中炎症细胞的浸润和新生血管的生成,抑制了小鼠角膜中IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF、MPP-9和LncRNA NR_033585等mRNA的表达,促进了PEDF和LncRNA chr8:129102060-129109035反向链等mRNA的表达。结论:GRh2可通过调控ERK-MAPK和PI3K-AKT信号通路的活化,从而调节HUVECs的功能,进而抑制角膜新生血管的生成。GRh2有望成为治疗角膜新生血管的新型药物。
【图文】：

但当 GRh2 的浓度在 125μM 以上时即可导致 MTTOD 的显著下降（图1）。这一结果提示，除非在极高的浓度下（125 μM 以上），GRh2 对 HUVECs 没有细胞毒性（图 1）。图 1 一定浓度下，GRh2 对 HUVECs 无细胞毒性HUVECs 细胞用不同浓度 GRh2（0.25 至 250 μM）预处理 48 h，通过 MTT 法测定 GRh2 对 HUVECs 细胞活力的影响。（“C”代表未经处理的对照组，与“C”相比，*P <0.05；结果表示为平均值 ±SD，，所有实验重复四次。）其次，我们用 VEGF（10ng/mL）预处理细胞 24h

GRh2 抑制 VEGF 诱导的 HUVECs 细胞10 μM）预处理 30 min 后再予 VEGF（10ng / mL），培养胞活力的影响。（“C”代表未经处理的对照组，与“C”相比有实验重复四次。）的 HUVECs 细胞增殖能力的影响LISA 实验和 Ki67 免疫荧光染色实验，发现VECs 细胞增殖显著增加（图 3，图 4 A-B显著降低了 HUVECs 的细胞增殖（图 3，图测细胞增殖的另一个指标[47]，在此实验 掺入被 GRh2 显著抑制（图 5）。GRh2 对 HUVECs 细胞增殖的抑制是呈剂增殖的抑制作用明显优于 1μM（图 2，图 3实，GRh2 在体外具有抑制 VEGF 诱导的
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R772.2

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本文编号：2639671