糖尿病视网膜病变患者血清特异性microRNA表达谱的初步研究

发布时间：2020-04-28 11:47

【摘要】：目的:本课题在临床研究部分,筛选糖尿病视网膜病变(DR)患者血清特异性microRNA(miRNA);在体内实验研究部分,检测糖尿病大鼠视网膜中候选miRNA及其靶基因的表达;在体外实验研究部分,验证高糖处理的人脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)中候选miRNA对其靶基因的靶向调控作用,目的旨在探讨血清miRNA可能成为DR潜在的发生预警、诊断分期和预后评估的生物标志物奠定理论基础。方法:在临床研究部分,使用miRNA微阵列芯片分析,筛选DR患者血清特异性miRNA表达谱;使用维恩图分析,确定DR患者血清特异性miRNA表达谱中的候选miRNA;使用实时定量PCR(qPCR),检测DR患者血清候选miRNA的表达水平;使用ROC曲线,评估血清候选miRNA对DR患者的诊断效能;使用生物信息学分析,预测DR患者血清候选miRNA的靶基因及其生物学功能和信号传导通路。在体内实验研究部分,使用二磷酸腺苷酶(ADPase)染色,观察糖尿病大鼠视网膜形态学特征;使用苏木精-伊红(HE)染色,观察糖尿病大鼠视网膜组织学特征;使用qPCR,在糖尿病大鼠视网膜组织中检测候选miRNA及其靶基因mRNA的表达水平;使用蛋白质免疫印迹法,在糖尿病大鼠视网膜组织中检测候选miRNA靶基因蛋白的表达水平。在体外实验研究部分,使用双荧光素酶报告系统,验证候选miRNA及其靶基因的靶向结合作用;使用细胞活性检测试剂盒(CCK-8),在高糖环境中检测候选miRNA对HUVEC细胞活力的影响;使用流式细胞仪,在高糖环境中检测候选miRNA对HUVEC细胞凋亡的影响;使用qPCR,在高糖环境中检测HUVEC中候选miRNA对其靶基因mRNA表达的影响;使用蛋白质免疫印迹法,在高糖环境中检测HUVEC中候选miRNA对其靶基因蛋白表达的影响。结果:在临床研究部分,miRNA微阵列芯片分析表明,在DR患者血清中存在特异性miRNA表达谱;维恩图分析表明,在DR患者血清特异性miRNA表达谱中可以确定4个候选miRNA,其中表达上调的包括miR-18b、miR-19b和miR-211,而表达下调的包括miR-23a;qPCR表明,血清miR-18b、miR-19b和miR-211的表达趋势与血清miRNA表达谱中的表达趋势一致,而血清miR-23a的表达趋势与血清miRNA表达谱中的表达趋势不一致;ROC曲线表明,血清miR-18b、miR-19b和miR-211对DR均有诊断效能,其中miR-211诊断效能最高,而血清miR-23a对DR没有诊断效能;生物信息学分析表明,miR-18b、miR-19b和miR-211共预测得到2081个靶基因,其中沉默交配型信息调节2同系物1(SIRT1)可能作为miR-211的一个靶基因;候选miRNA的靶基因参与的生物过程包括基于DNA为模板的转录、RNA聚合酶II启动子转录的正向调节和基于DNA为模板的转录调节等,细胞组成包括细胞质、细胞核和细胞质膜等,分子功能包括蛋白质结合、金属离子结合和DNA结合等;候选miRNA的靶基因参与的信号通路包括轴突导向通路、心肌细胞肾上腺素能信号转导通路和内噬作用通路等。在体内实验研究部分,ADPase染色表明,糖尿病大鼠视网膜新生血管密度显著增加,并且随着糖尿病病程的延长逐渐加重;HE染色表明,糖尿病大鼠视网膜突破视网膜内界膜细胞核计数显著增加,并且随着糖尿病病程的延长逐渐加重;qPCR表明,miR-211在糖尿病大鼠视网膜中表达显著上调,并且随着糖尿病病程的延长表达逐渐增加,而SIRT1 mRNA在糖尿病大鼠视网膜中表达显著下调,并且随着糖尿病病程的延长表达逐渐减少;蛋白质免疫印迹法表明,SIRT1蛋白在糖尿病大鼠视网膜中表达显著下调,并且随着糖尿病病程的延长表达逐渐减少。在体外实验研究部分,双荧光素酶报告系统表明,miR-211及其靶基因SIRT1存在靶向结合作用;CCK-8表明,在高糖环境中转染antagomiR-211的HUVEC细胞活力显著上升;流式细胞仪表明,在高糖环境中转染antagomiR-211的HUVEC细胞凋亡显著下降;qPCR表明,在高糖环境中转染antagomiR-211的HUVEC SIRT1 mRNA表达显著上调;蛋白质免疫印迹法表明,在高糖环境中转染antagomiR-211的HUVEC中SIRT1蛋白表达显著上调。结论:此次临床和实验研究表明,DR患者血清中存在特异性miRNA表达谱;血清miR-211可能作为一个新的具有高度敏感性和特异性的生物标志物,并且通过靶向调控SIRT1影响DR的发生和发展。
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表达谱,血清,博士学位论文

中国医科大学博士学位论文3.2 miRNA 芯片检测结果使用 miRNA 芯片检测血清 miRNA 表达谱（图 1）。结果表明，HC 组对比 NDR组，共 38 个表达显著失调的 miRNA，其中 24 个 miRNA 表达上调，14 个 miRNA表达下调；HC 组对比 DR 组，，共 45 个表达显著失调的 miRNA，其中 22 个 miRNA表达上调，23 个 miRNA 表达下调；NDR 组对比 DR 组，共 40 个表达显著失调的miRNA，其中 24 个 miRNA 表达上调，16 个 miRNA 表达下调。

表达谱,火山,血清,特异性表达

23 个 miRNA 表达下调；NDR 组对比 DR 组，共 40 个表达显著失调的miRNA，其中 24 个 miRNA 表达上调，16 个 miRNA 表达下调。图 1 血清 miRNA 表达谱中表达失调的 miRNA使用火山图分析血清 miRNA 表达谱（图 2）。横坐标表示两组间差异倍数，纵坐标表示 P 值，两条垂直线分别代表差异倍数上调 2.0 倍及下调 0.5 倍，水平线对应 P = 0.05。结果表明，红点代表特异性表达上调的 miRNA，绿点代表特异性表达下调的 miRNA。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R774.1

【参考文献】