Dickkopf-1抑制人晶状体上皮细胞中Wnt3a诱导的细胞迁移和EMT

发布时间：2020-04-29 06:45

【摘要】：目的通过行兔眼白内障囊外摘除术建立后囊膜混浊(posterior capsular opacification,PCO)的动物模型,检测房水中Dkk1(Dickkopf-1)及Wnt3a的含量,观察囊外摘除术后加入Dkk1组与对照组细胞迁移及上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的发生情况,研究Dkk1对于Wnt3a诱导的EMT及细胞迁移的的影响并探索可能的细胞机制。寻求新的有效抑制PCO的靶点,力求为白内障术后PCO的发生提供更好的防治方案。方法选取新西兰大耳白兔24只,术前抽取右眼房水检测其Wnt3a和Dkk1的浓度,右眼行白内障囊外摘除手术,术后兔子被随机分为两组(每组12只),即磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline,PBS)处理组和Dkk1治疗组。将大约1ml Dkk1(30ng/ml)或1ml PBS分别注射到右眼的前房中。在手术后第十四天,抽取右眼房水检测Wnt3a和Dkk1的浓度。摘除左眼和右眼,均使用福尔马林固定,石蜡包埋,并行酶联免疫吸附试验,免疫组化(immunohistochmeistry,IHC)染色,蛋白质免疫印迹(western blot,WB),免疫荧光,细胞迁移实验等进行组织学分析。结果手术后第14天,大多数用PBS治疗的右眼出现致密纤维化或明显的上皮混浊,用Dkk1治疗的右眼后囊显示轻度混浊。IHC结果表明,手术后14天,用PBS处理的右眼显示出与PCO相关的几个特征,包括后囊中央明显的细胞增殖和显著的β-连环蛋白(β-catenin)核转移。Dkk1治疗组与PBS治疗组相比,右眼后囊膜β-catenin核转移较少(32.8±6.2%vs.9.2±3.1%,P0.05)。酶联免疫吸附测定法显示,结果显示,加入PBS处理后,右眼前房内Wnt3a的平均浓度为173.8 pg/ml,平均Dkk1浓度为35.0 pg/ml。WB和免疫荧光染色分析,Wnt3a转染的人晶状体上皮细胞系(HLE-B3)细胞中诱导E-钙粘蛋白的含量下降,纤连蛋白和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的含量增加。然而,在Wnt3a过表达的细胞中加入Dkk1,检测到HLE-B3细胞中E-钙粘蛋白表达增加,纤连蛋白表达降低。此外免疫荧光还显示:Wnt/β-catenin信号通路参与了EMT和LEC迁移,而Dkk1通过抑制β-catenin的核积累抑制了EMT和细胞迁移。伤口愈合实验结果显示Wnt3a在HLE-B3细胞中引起明显的水平和垂直迁移。而Dkk1能够阻断Wnt3a诱导的HLE-B3细胞迁移。Transwell迁移实验:与对照组相比,Wnt3a过表达的HLE-B3细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数最多,而加入Dkk1的Wnt3a过表达的HLE-B3细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数减少。明胶酶谱结果显示Wnt3a显着增加了应力纤维的数量,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-1的表达以及MMP-2和MMP-9的活性。相比之下,Dkk1处理显着减少应力纤维的量并抑制Wnt3a诱导的MMP-1表达和MMP-2和MMP-9活性的增加。结论1.Dkk1抑制兔PCO模型中的PCO形成。2.Dkk1逆转了Wnt3a过表达的HLE-B3细胞中EMT相关蛋白的表达。3.Dkk1抑制Wnt3a过表达的HLE-B3细胞的迁移。4.Dkk1抑制HLE-B3细胞中Wnt3a诱导的β-catenin核转移。5.Dkk1抑制Wnt3a过表达的HLE-B3细胞中细胞骨架合成、MMP1的表达、MMP-2和MMP-9的活性。
【图文】：

图 1 Dkk1 抑制家兔 PCO 模型中的 PCO 形成。术后 14 天，PBS 治疗的右眼明显的后囊膜混浊，Dkk1 治疗的右眼后显示轻度混浊。图 2 术后 14 天，，用 PBS 或 Dkk1 的处理，发生细胞沿右眼后囊迁移，α-SMA 表达增强，具

12内蒙古医科大学硕士研究生学位论文（2018）Wnt/β-catenin 通路干扰的结果。图 1 Dkk1 抑制家兔 PCO 模型中的 PCO 形成。术后 14 天，PBS 治疗的右眼明显的后囊膜混浊，Dkk1 治疗的右眼后显示轻度混浊。
【学位授予单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R779.6

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