鼻咽癌相关的STIL基因的筛选与鉴定及其在CNE-2Z细胞中的功能研究

发布时间：2020-05-14 13:37

【摘要】：鼻咽癌在我国属于高发恶性肿瘤之一,且发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。在中国南方和东南亚地区,尤为高发。鼻咽癌的病因学研究表明:遗传因素、EB病毒感染、环境因素及饮食习惯与鼻咽癌的发生有密切关系。目前鼻咽癌治疗还是以放疗为主,因其发病位置的特殊性以及对放射的高敏性。随着治疗手段的不断改进,分子靶向治疗成为治疗鼻咽癌的新手段。将分子靶向治疗与放化疗联合,可明显提高治疗效果。鼻咽癌的发生是一个多阶段、多基因和多步骤的复杂过程,寻找其发生发展过程中的关键靶点,已成为鼻咽癌靶向治疗研究的热点。STIL基因是中心粒复制的必要组分,其表达水平与中心粒的数量有密切联系。而中心体的异常又会导致分裂时染色体出现异倍化现象。肿瘤的普遍特征包括了中心体异常和染色体不稳定性,因此STIL基因在肿瘤的发生发展过程中可能起重要作用。研究指出,STIL只在增殖细胞中表达,且在癌细胞中与转移和预后差相关。另有不少研究表明,STIL基因与卵巢癌、胰腺癌、肺癌和白血病等多种肿瘤的发生发展有关。敲减STIL基因可以有效抑制癌细胞的增殖,但目前还没有见到有关STIL基因与鼻咽癌之间的关系的研究报道。本课题前期通过转录组芯片对鼻咽癌及其癌旁组织进行分析,挑选出在癌组织中显著表达上调的基因,利用生物信息学结合文献筛查,初筛出34个基因。在此基础上,采用qPCR检测和HCS细胞增殖筛选方法进一步验证,复筛出对鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖抑制阳性的基因,再对复筛出的基因在临床样本组织中的表达进行检测,最终确认目的基因进行后续研究。通过构建目的基因的RNA干扰慢病毒载体,感染鼻咽癌细胞株CNE-2Z,观察其对细胞生物学行为的影响。得出的结果如下:1)在鼻咽癌CNE-2Z细胞中进行qPCR检测,筛选出的34个与鼻咽癌可能有关的基因中有32个基因高表达;2)选取32个基因中表达水平前20的基因进行HCS细胞增殖筛选,以增殖检测第5天、Ctrl组(阴性对照组)细胞计数倍数值比实验组细胞计数倍数值的Fold change值为判断依据。当Fold change≥2.0时,即该实验组细胞相比Ctrl组细胞,细胞增殖显著减缓,筛选出KLHL42和STIL基因;3)qPCR检测KLHL42和STIL基因在鼻咽癌组织及其癌旁组织中的表达,KLHL42在4对强参考和4对弱参考样本中表现为上调,STIL在4对强参考和3对弱参考样本中表现为上调。参考前期的mRNA芯片结果,确定了STIL基因进行下游实验;4)成功构建了以STIL为靶点的RNA干扰慢病毒载体;5)鼻咽癌细胞在慢病毒质粒感染后,CNE-2Z细胞中STIL基因的mRNA和蛋白表达水平显著被抑制,同时抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,且还影响细胞周期。总之,本研究证实了STIL基因可影响鼻咽癌细胞CNE-2Z的增殖,表明STIL基因有望作为鼻咽癌治疗的靶点,为鼻咽癌的分子靶向治疗提供新的靶点。
【图文】：

示意图,示意图,号外,基因

华南理工大学硕士学位论文出现位点特异性重排。SCL 基因编码生成造血转录因子，其启动子区和 SIL 基因的编区被删除引起SIL和STIL基因发生重排。重排的结果是1号染色体上STIL基因的5’ 端 SCL 基因的编码区并列部分发生中间缺失[27]。如图 1-1 所示，形成的 STIL/SCL 融合RNA 是 STIL 基因 1 号外显子和 SCL 3 号外显子以头尾相接的方式连接。1 号外显子 3 号外显子都处在 5’UTR 区，导致 STIL 基因的启动子和增强子进一步促使 SCL 全长因的表达。正常情况下，STIL 基因在 T 淋巴细胞中表达，，而 SCL 基因并不表达。但当 STIL 基因驱使 SCL 基因表达，白血病 T 细胞发生 STIL/SCL 重排后，SCL 基因即达。有报道指出 T 淋巴细胞中 SCL 基因的错误表达具有转化活性[28-30]。

中心粒

第一章绪论STIL 蛋白表达水平开始上升（在 G1晚期和 S 早期）。当 STIL 蛋白的浓度在细胞质中达到一定水平时，新的子代中心粒开始招募细胞质中的 STIL 蛋白，进行下一轮的中心粒（中心体）复制。为了对中心粒（中心体）的复制机制了解的更为透彻，Moyer[34]等通过在人类细胞中使用基因编辑技术构建化学遗传系统，利用 ATP 类似物特异性抑制内源性 PLK4。如图 1-2 所示，从中证明了 STIL 定位于中心粒上需要 PLK4 的参与。PLK4 通过自我磷酸化激活，再磷酸化 STIL，促进中心粒装配分两步。首先，PLK4 活化促进 STIL 招募到中心粒上；其次，STIL 通过 PLK4 的引导与 SAS6 的 C 末端直接结合。这一研究揭示了细胞周期通过调控 STIL 的蛋白量从而影响 PLK4 激活时间的分子基础。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.63

【参考文献】