自身免疫性内耳疾病相关的分子机制研究

发布时间：2020-06-11 11:51

【摘要】：听力损失或耳聋(hearing loss)是一种常见的耳鼻咽喉科疾病。2013年世界卫生组织统计显示全球已有高达3.6亿听力残障人士。耳聋患者通常伴有不同程度的耳鸣、眩晕、失眠、焦虑、抑郁,甚至恐惧和外人交流,导致患者生理和心理都面临相当大地痛苦,生活质量明显下降,因而如何预防和治疗听力损失或耳聋已成为全球关注的公共健康问题。病因学研究认为耳聋可由遗传、感染、药物、噪音、创伤、衰老以及自身免疫等因素诱发。其中,自身免疫性内耳病(Autoimmune inner ear disease,AIED)是少数进展迅速,但经及时、恰当治疗后可部分或全部逆转的病因之一。因此,探究AIED发病机制以及探寻如何及时诊断并有效治疗AIED具有重要的临床意义。近年研究认为内淋巴囊(endolymphatic sac,ES)是内耳的组成性免疫防御系统。当内耳受抗原刺激后,ES部位的免疫活性细胞一方面通过增殖分化大量增加,另一方面通过释放的炎症介质介导全身血流循环中炎症细胞的招募,进而放大ES的免疫作用,完成抗原捕捉、吞噬和清除过程。若持续且过于强烈的免疫应答反应发生,则可引发耳蜗组织发生一些病理性改变,最终导致AIED形成。由此提示,靶向ES的免疫或炎症相关基因可能是治疗AIED的潜在途径。但目前关于ES中参与免疫或炎症的基因仍知之甚少。由于无法进行活体内耳组织检查,目前AIED诊断主要通过临床症状、实验室检查以及影像学检查进行综合判断。其中,血液检测是最主要的手段,包括特异性抗原(如HSP-70)、免疫相关的细胞(如淋巴细胞)以及分泌的细胞因子(如TNF)。尽管如此,目前临床上用于诊断AIED的标志物仍然有限,需进一步探寻。miRNAs是一类分子大小约为22个核苷酸的内源性非编码单链小RNA,其通过转录后水平抑制靶基因的表达,从而参与调控疾病的发生、发展及预后。因此,调控免疫或者炎症因子的miRNA可能是潜在的诊断AIED的分子标志物。目前已有文献探讨了 miRNAs对自身免疫性甲状腺疾病以及自身免疫性胰腺炎的诊断性能,但关于AIED相关的miRNAs还少见报道。基于目前存在的问题,本论文拟主要开展了以下三个方面的工作:第一部分:研究目的:利用ES转录组芯片数据筛选炎症相关的基因,为AIED治疗提供潜在的靶点。研究方法:从公共数据库欧洲生物信息研究所下载E-MEXP-3022数据,此数据包含6个大鼠样本,即3个ES样本以及3个纯的ES旁硬脑膜组织。利于RMA(Robust Multichip Average)算法进行原始数据的预处理;运用微阵列数据法线性模型(linear model for microarray data methods,LIMMA)筛选样本间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。阈值设定为P值0.05且丨log2FC|1;使用DAVID在线工具分别预测上调和下调基因可能参与的功能(gene ontology,GO)和信号通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG);使用 STRING 数据库预测分析 DEGs 编码的蛋白质之间的互作关系,采用Cytoscape软件进行PPI网络构建,随后采用CytoNCA插件计算蛋白质网络节点的拓扑学特征(包括节点的度、介数中心性以及子图中心性)以筛选网络中的关键基因;采用Cytoscape软件的ClusterONE插件挖掘PPI网络中存在的功能相关且基因之间紧密联系的模块,随后对每个子网络同样进行功能富集分析;为了从多角度和多物种水平确认基因的重要性,我们将从大鼠筛选到的DEGs与2015年M(?)ller等鉴定的人的ES组织炎症,免疫相关基因取交集,以获得共同的基因。研究结果:根据设定的阈值,我们发现ES和对照组织之间有612个基因表现差异表达,包括396个上调和216个下调基因。功能富集分析结果表明上调DEGs富集到116个显著的GO条目,包括细胞粘附GO:0007155-cell adhesion(富集的基因包含Itgal 和 Spp1);T 细胞协同刺激 GO:0031295-T cell co-stimulation(富集的基因包含Cc121和Cc119);细胞因子IL-1应答GO:0070555-response to IL-1(富集的基因包含Cc121和Cc19),而下调DEGs富集到77个显著的GO条目,同样主要参与细胞粘附(GO:0007155～cell adhesion,富集的基因包含Tgfbi),炎症性Toll受体信号通路(GO:0002224～toll-like receptor signaling pathway,富集的基因包含 Tlr2,Tlr7,Tlr8)以及阳性调节 NF-kB 入核(GO:0042346～positive regulation of NF-kappaB import into nucleus,富集的基因包含Tlr2和Tlr7)。上调DEGs富集到6个显著的KEGG通路,包括紧密连接(rno04530:Tight junction,富集基因包括 Cldn4),ECM 受体互作(rno04512:ECM-receptor interaction,富集基因包括Itgal和Sppl),白细胞跨内皮转移(rno04670:Leukocyte transendothelial migration,富集基因包括 Cldn4),而下调基因富集到7个KEGG通路,包括炎症相关的疾病通路,如疟疾(rno05144:Malaria,富集的基因包含Tgfb3和Tlr2)。将所有的差异基因映射到从STRING数据库获得的蛋白互作关系对,结果构建成一个包含338个节点和777个PPI对的PPI网络。随后通过计算三种拓扑学特征,发现Itgal和Spp1是潜在重要的基因。采用ClusterONE方法从PPI网络中提取出5个显著的、蛋白之间紧密关的子网络。其中模块1和模块2显著富集到炎症(包含Ccl21和Ccl19基因)以及细胞粘附(包括Cldn4基因)相关的通路。通过和2015年M(?)ller等的研究炎症基因取交集,结果获得了 6个共同的基因,包括Tlr7,Tlr2,Tlr8,Lpo,Gzmm以及Mucl。功能分析证明Tlr7,Tlr2,Tlr8和Gzmm富集到免疫相关的通路。研究结论及意义:ES 组织中 Itga1、Spp1、Ccl21、Ccl19、Cldn4、Tlr7、Tlr2 以及Tlr8的异常表达可能是AIED发生的潜在机制。第二部分:研究目的:采用miRNA二代测序技术鉴定与AIED显著相关的生物标志物。研究方法:提取豚鼠内耳膜组织制备内耳抗原,随后与同体积的完全弗氏佐剂混合,颈背部皮下多点注射构建AIED模型。于免疫一周和两周后分别选取部分豚鼠处死以采用病理组织学分析判断模型的成功性。收集3只成功建模的AIED鼠和对照正常鼠的血清样本进行miRNA深度测序。采用FastQC软件对原始Fastq文件数据进行质量控制,去除接头序列以及低质量的序列;采用miRDeep2对的miRNA数据定性,定量和归一化,随后采用Student's进行差异表达miRNAs的筛选。差异表达miRNA闽值设定为:p0.05;差异倍数1.5或1/1.5;表达均值log2(5RPM);采用TargetScan(物种选为Mouse)算法进行鼠源差异表达miRNA的靶基因预测,miRNA-靶基因互作调控网络采用Cytoscape软件进行展示;采用clusterProfiler对网络基因进行GO和KEGG通路富集分析。研究结果:病理学检测结果发现免疫1周后,豚鼠蜗轴出现少量炎性细胞(主要是淋巴细胞)浸润;螺旋神经节细胞数量明显减少,排列稀疏紊乱;Cortis器皱缩,偶有内、外毛细胞缺失、坏死;可见少量壶腹嵴毛细胞空泡变性。说明AIED模型已构建成功,随后采用免疫一周的样本进行miRNA表达谱分析。根据设定的阈值,在两组样本之间共检测到22个差异表达miRNA,包括10个上调表达和12个下调表达。利用TargetScan软件,我们为22个差异表达的miRNA预测到1958个潜在的靶基因。随后利用它们之间的互作构建了 miRNA-mRNA调控网络,其包含22个miRNAs和1696个靶基因。采用clusterProfiler对差异miRNA的靶基因进行功能分析,结果发现分别有8个miRNA的靶基因富集到GO条目(miR-10b-3p,let-7j,miR-1943-5p,miR-196b-5p,miR-338-3p,miR-455-5p,miR-8112,miR-92b-3p)和 KEGG 通路(miR-10b-3p,let-7c-5p,let-7g-5p,let-7j,miR-181c-5p,miR-181d-5p,miR-222-3p,miR-8112)。其中三个miRNAs的靶基因在GO和KEGG通路分析时都富集到,包括miR-10b-3p,let-7j以及miR-8112。其中,miR-10b-3p主要通过调控炎性趋化因子(如Ccl12)来参与AIED;miR-8112主要通过靶向影响Wnt信号通路基因,包括Wnt9b,wnt 3a,Wnt2b;let-7j的靶基因主要参与鞘糖脂合成以及黏蛋白型O-聚糖的合成,如Galnt2。研究结论及意义:血清miR-10b-3p、miR-8112以及let-7j可能是潜在的诊断AIED的生物标记物。它们主要通过参与调控炎症相关靶基因来预测AIED的发病。第三部分:研究目的:整合分析ES组织转录组和血清miRNA表达谱数据以获得调控ES的miRNAs,为临床诊断和治疗提供靶点。研究方法:采用Venn图对比分析大鼠ES组织中筛选的612差异基因和小鼠血清中筛选的差异miRNA的1958个靶基因,获得它们之间共同的基因。使用在线DAVID工具分别以大鼠和小鼠为物种预测共同基因参与的功能,包括GO和KEGG信号通路途。P0.05被视为显著富集结果。研究结果:韦恩图结果显示大鼠ES组织中筛选的612差异基因和小鼠血清中筛选的差异miRNA的1958个靶基因之间有44个是共同的。采用大鼠作为物种,DAVID富集分析证明上述44个基因可参与10个GO条目,而采用小鼠作为物种,则可获得13个GO条目。其中两个物种分析都获得可以参与细胞粘附的细胞外基质相关的 GO 条目,包括 G0:0005578～proteinaceous extracellular matrix 和GO:0031012～extracellular matrix。富集到的基因包含 SBSPON、VWF、WNT16、ADAMTS8、SFRP1、LAMC2、ADAMTS12、PLSCR1。这些基因依次分别受到miR-1943-3p、miR-532-3p、let-7g-5p、miR-340-3p、miR-874-3p 以及 miR-511-3p 的调控。其中miR-511-3p和其靶点基因ADAMTS12的表达方向是相反,间接证明它们之间的负调控关系。此外,以大鼠为物种还发现共同基因可与富集到T细胞协同刺激的GO条目GO:0031295～T cell costimulation,证明这些富集的基因(EFNB3,DPP4)是参与AIED发生发展的重要靶点。EFNB3可受到miR-1943-5p的调控,而DPP4受miR-196-5p的调节,且这两组miRNA-mRNA之间的表达都是负相关的。研究结论及意义:miR-511-3p-ADAMTS12,miR-1943-5p-EFNB3 以及 miR-196-5p-DPP4互作对通过参与细胞外基质粘附和T细胞协同刺激来促进AIED的发生,因此它们可能是AIED诊断和治疗的潜在靶点。
【图文】：

热图,差异表达基因,聚类

因表现出差异表达，包括３９６个上调基因和２１６个下调基因（表２．１）。热图分析表逡逑明所鉴定的ＤＥＧｓ可以明显的将ＥＳ和对照组区分开来，，证明了邋ＤＥＧｓ的有效性。差异表逡逑达基因的ｈｅａｔｍａｐ图见图１，可以将样本正确的分为两类（图２．邋１）。逡逑３０逡逑

自身免疫性内耳疾病相关的分子机制研究

图２．２邋ＰＰＩ网络
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R764.3

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