17-β雌二醇在TAO成纤维细胞氧化应激中的保护作用研究

发布时间：2020-07-07 04:52

【摘要】：研究背景：甲状腺相关性眼病（Thyroid associated Ophthalmopathy，TAO）是最常见的眼眶疾病，在欧美国家中，TAO的发病率男、女分别为16/10万和3/10万，目前国内的发病率尚无明确数据，但据国内的一些城市的流行病学调查表明，随我国食盐中含碘量的增加，甲状腺功能亢进(简称甲亢)发病率出现上升趋势，而甲亢是导致TAO最主要的因素，其中大约25% 50%的甲亢患者会出现TAO。由此可见，TAO的发病率也有逐年增高。TAO是一组非常复杂的眼眶病，轻者可以导致眼球突出、眼睑闭合不全，从而影响患者外观；重者可以导致复视、视力下降甚至失明。然而TAO的病因尚不明确，其主要治疗方案目前也只是局限于对症治疗，如激素冲击疗法、复视矫正术、提上睑肌延长术和眼眶减压术等。况且大部分患者以眼球突出就诊，就诊时往往已经有很明显的眼部症状，常规给予激素冲击治疗的完全治愈率几乎为0%，治疗后易出现反复复发，这些都严重的影响了TAO患者的生活质量。自Wilson首次发现在Grave’s病患者中有氧化自由基的活性增加以及抗氧化活性的减少以来，氧化应激开始进入Grave’s病研究者的视野中，氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用的失衡，倾向于氧化。目前越来越多的基础和临床研究证据证明氧化应激的代谢参与了甲状腺相关眼病的自身免疫的病理发病过程。因此，人们开始探索安全有效的甲状腺相关眼病的抗氧化治疗方法，但目前抗氧化治疗方面的研究较少，抗氧化药物也多为口服，作用缓慢。最近一些氧化应激参与的疾病如阿尔茨海默病、糖尿病、动脉样硬化等疾病的研究中发现，17 β雌二醇能有效抑制相关疾病中的氧化应激水平，且副作用小，可局部注射或经皮局部给药。因此我们则致力于探索17 β雌二醇在甲状腺相关眼病成纤维细胞中氧化应激损伤方面的作用，希望能为甲状腺相关眼病探索出一条安全、有效、易普及的抗氧化治疗方案。本课题拟采用过氧化氢(H2O2)作用于甲状腺相关性眼病患者眼外肌来源成纤维细胞(orbital fibroblasts，OF)，制备外源性氧化应激细胞模型，探索17β-雌二醇（E2）在TAO成纤维细胞氧化应激过程中的保护作用。实验共分为两部分：第一部分，建立TAO成纤维细胞外源性氧化应激细胞模型，利用MTT法明确干预成纤维细胞的H2O2的浓度，并且明确17-β雌二醇的对TAO成纤维细胞增殖是否有影响，为后期17-β雌二醇干预后氧化应激相关指标的检测做准备；第二部分，研究不同浓度的17-β雌二醇干预成纤维细胞外源性氧化应激细胞模型后抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂质氧化损伤产物MDA的水平，分析17-β雌二醇的浓度与抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂质氧化损伤产物MDA的水平的关系。第一部分：TAO成纤维细胞外源性氧化应激细胞模型的建立目的:采用H2O2干预TAO成纤维细胞，建立TAO成纤维细胞的外源性氧化应激细胞模型，为下一步不同浓度17-β雌二醇的干预此细胞模型后CAT、SOD、GSH/GSSH和脂质氧化损伤产物MDA的检测做准备。方法：眼眶成纤维细胞培养来源于TAO限制性斜视矫正术及严重性TAO行眼眶减压术取下的眼外肌，采用组织块培养法培养TAO眼眶成纤维细胞，采用MTT法确定TAO成纤维细胞亚致死剂量的H2O2浓度作为TAO成纤维细胞的干预浓度。此外，继续采用MTT法观察17-β雌二醇对TAO成纤维细胞增殖的影响。结果：（1）数据被表示为四个独立实验的结果的平均值±SD。H2O2干预组与空白对照组的细胞成活率在H2O2浓度为60μmol/L的差异是有统计学意义的（76.8%，P=0.003＜0.05），而在40μmol/L时无明显差异（87.4％，P=0.104）。（2）17-β雌二醇干预24h后，结果显示17-β雌二醇干预组与空白组在细胞数量上无明显差异。结论：（1）将40μmol/L作为制备外源性氧化细胞模型H2O2的干预浓度。（2）17-β雌二醇干预24h对TAO成纤维细胞的增殖无明显影响。第二部分：不同浓度的17-β雌二醇干预成纤维细胞外源性氧化应激细胞模型后抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂质氧化损伤产物MDA的水平的检测目的:研究不同浓度的17-β雌二醇干预外源性氧化应激细胞模型后，检测其抗氧化酶CAT、SOD、GSH/GSSH和脂质氧化损伤产物MDA的水平，以明确17-β雌二醇的抗氧化作用。方法：将TAO患者来源的成纤维细胞随机分为6组培养:A组(空白组：无17-β雌二醇、无H2O2)、B组(单纯40μmol/L H2O2刺激组)、C组(40μmol/L H2O2+2.5nmol/L17-β雌二醇)、D组(40μmol/L H2O2+5nmol/L17-β雌二醇)及E组（40μmol/L H2O2+10nmol/L17-β雌二醇）。17-β雌二醇干预组在加入H2O2前先加入17-β雌二醇预处理，并放于含体积分数5%CO2细胞恒温培养箱孵育24h，之后H2O2干预90min后，检测各组过氧化氢酶（CAT）和超氧化岐物酶（SOD）的活性、丙二醛(MDA)以及谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)的水平。结果：（1）17-β雌二醇对TAO成纤维细胞氧化应激过程中抗氧化体系（SOD、CAT和GSH/GSSH）的影响：H2O2处理1.5h后,除了C组的GSH/GSSH，17-β雌二醇预处理组（C、D、E组）与单纯H2O2组（B组）在SOD、CAT、GSH/GSSH和MDA水平差异均有统计学意义(P0.05)，且随着17-β雌二醇浓度的增加，各抗氧化酶活性也随之增加。而17-β雌二醇干预组（C、D、E组）与空白对照组（A组）在SOD、CAT、GSH/GSSH和MDA水平差异均有统计学意义(P0.05)；（2）17-β雌二醇对TAO成纤维细胞氧化应激过程中脂质氧化产物MDA的影响：H2O2干预后，各组的MDA含量较空白对照组均显著增多（P＜0.05），且随着预干预的17β雌二醇的浓度越小，MDA的含量越高，单纯H2O2干预组的MDA含量最高，且与17-β雌二醇干预的各组的差异均有统计学意义(P0.05)。结论：1、雌二醇干预组的抗氧化酶类均比无雌二醇干预组高，且与17-β雌二醇的浓度呈正相关； 2、雌二醇干预组的脂质氧化反应产物MDA较无雌二醇干预组低，且与17-β雌二醇的浓度成负相关。总之，17-β雌二醇可明显增高TAO成纤维细胞内抗氧化酶的水平，从而增强其对外源性氧化应激的抗氧化能力，减轻其氧化损伤，且成剂量相关性。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R771.3
【图文】：

示意图,氧化应激,酶类,示意图

原型谷胱甘肽(GSH)和氧化谷胱甘肽(GSSG)的检测。发现TAO成纤维细胞较健康人的成纤维细胞对氧化应激的反应更为敏感，这有可能是因为抗氧化酶谱的减少甚至耗竭所致（见图1）。由此可得出，假如我们找到有效的治疗措施能够终止氧化应激对TAO成纤维细胞的损伤，则有可能对缓解TAO的症状有着巨大的意义。图 1 氧化应激酶类在氧化应激过程中的作用及变化示意图目前 TAO 的抗氧化治疗研究较少，Bouzas 进行了一项小例数试验，使用别嘌呤醇和尼克酰胺对 TAO 患者进行抗氧化治疗，显示其对轻度和中度 TAO 有非常好的效果，无副作用，且患者满意度较高[15]。此外，最近欧洲进行了一项大型临床试验，给予轻到重度的 TAO 患者硒治疗

相差显微镜,细胞生长

图 2 可见细胞生长融合，倒置相差显微镜×10 MTT 法确定亚致死剂量的 H2O2浓度(即外源性氧化应激细模型中 H2O2的干预浓度)实验以 MTT 法检测细胞活性，细胞 MTT 还原率(OD492值)越高，反映细胞盛、活力越强，以 0μmol/LH2O2组成纤维细胞的细胞存活率为 100％，计成纤维细胞的存活率。不同浓度 H2O2干预 TAO 眼眶成纤维细胞 90min 后，细胞的吸光值(OD 值)及计算出的细胞成活率分别见图 3 和表 1。应用单因素，可得出结果：H2O2干预组与空白对照组的细胞成活率在 H2O2浓度为 60μmo是有统计学意义的（76.8%，P = 0.003＜0.05），而在 40μmol/L 时差异无义（87.4％，P =0.104）（见图 1）。基于这些结果，认定 40μmol/L 为 H2O 眼眶成纤维细胞的亚致死剂量，即作为下面的实验外源性氧化应激细胞模型

【参考文献】