ENU诱变小眼畸形小鼠模型的分子机制研究

发布时间：2017-03-31 09:38

  本文关键词：ENU诱变小眼畸形小鼠模型的分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：乙烷基亚硝基脲(Ethylnitrosourea, ENU)是一种人工合成的能导致多种生物体发生随机、单碱基突变的化合物。ENU能不依赖于任何代谢过程,而通过烷化反应将其乙烷基加入DNA碱基的部分基团,从而引起碱基配对错误,在较短时间内诱导小鼠产生大量随机突变表型。采用ENU诱变手段,本实验室得一种常染色体显性小眼畸形小鼠,该突变小鼠表现为一侧或双侧小眼畸形,且严重程度不一,该小鼠突变纯合子表现为出生时无眼且很快死亡。本研究以该突变系小鼠为研究对象,从以下三个部分开展研究工作：1 ENU诱变获得一例小眼小鼠通过ENU诱变,在G1代小鼠中筛查发现了小眼表型的小鼠, 将其中一例小眼畸形C57BL/6(B6)雄性小鼠与正常B6雌鼠合笼,获得B6背景的杂合子小鼠,观察并记录100只后代中,其-中23只小鼠具有小眼表型。将B6背景杂合子小鼠与DBA(D2)小鼠配种获得F1代小鼠,F1代小鼠回交B6得到N2代小鼠,记录的561只N2代小鼠中有21只表现为小眼表型。2小眼突变基因的定位及鉴定为了定位该突变基因,将(B6-D2)F1突变杂合子小鼠回交B6获得N2代小鼠,提取N2代小鼠的鼠尾DNA,利用微卫星对突变小鼠的染色体进行全基因组扫描。定位结果表明在44个样品中突变基因与微卫星D18mit124与D18mit184之间未发生一例交换,最终将突变基因定位于微卫星D18mit124与D18mit184之间。通过对局部区域基因功能分析,初步判定RAX基因为本突变候选基因。设计扩增针对RAX基因编码区引物,对野生型及小眼小鼠DNA进行PCR扩增。产物回收后进行测序比对,结果显示突变小鼠RAX基因编码第559位碱处发生C到T的转换,导致编码区第187位密码子CGA(编码精氨酸)变为终止密码子TGA,引起蛋白编码提前终止。3 R187X无义突变对RAX蛋白功能影响分析RT-PCR扩增野生型及突变纯合子小鼠RAX基因,将其克隆到pMD19-T载体上,然后再亚克隆到pCMV-tag2B真核表达载体,分别命名为pCMV-tag2B-wRAX、 pCMV-tag2B-mRAX。用脂质体2000将以上重组载体转染于COS-7细胞,分别用于后续的间接免疫荧光、PI染色以及EMSA实验。间接免疫荧光及PI染色结果显示正常及突变RAX蛋白都定位于细胞核,故排除R187X突变对RAX蛋白核定位的影响。EMSA实验结果显示R187X无义突变影响RAX蛋白与相关DNA序列结合,从而导致小鼠小眼表型。
【关键词】：ENU 小眼畸形 基因定位 RAX基因及蛋白 EMSA
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R771;R-332
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 符号说明9-10
• 第一部分 文献综述10-25
• 第一章 ENU诱变及突变基因的定位和克隆10-14
• 1 ENU诱变的基本原理10-11
• 2 诱变及筛查的手段11-12
• 3 突变基因的定位及克隆12
• 4 国内外ENU诱变研究进展12-14
• 第二章 小眼畸形及其相关基因14-16
• 1、SOX2(sex determining region Y-box2)14
• 2、OTX2(orthodenticle homeobox2)14-15
• 3、PAX6(paird box6)15
• 4、RAX(retina and anterior neural fold homeobox)15-16
• 第三章 凝胶电泳迁移率实验16-18
• 参考文献(References)18-25
• 第二部分 实验内容25-58
• 第三章 ENU诱变获得一例小眼畸形小鼠25-33
• 1 材料25-26
• 2 实验方法26-27
• 3 结果27-28
• 4 讨论28-29
• 参考文献(References)29-33
• 第四章 小眼畸形突变基因的定位及鉴定33-39
• 1 材料33-34
• 2 实验方法34-35
• 3 结果35-36
• 4 讨论36-38
• 参考文献(References)38-39
• 第五章 R187X无义突变对RAX蛋白功能影响分析39-58
• 1 材料39-41
• 2 方法41-52
• 3 结果52-56
• 4 讨论56
• 参考文献(References)56-58
• 致谢58-59
• 攻读学位期间发表的学术论文目录59-60

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本文编号：279378