锌指蛋白A20在Behcet病和Vogt-小柳原田综合征发病机制中作用的研究

发布时间：2020-08-15 16:39

【摘要】：葡萄膜炎是眼部炎性疾病的一种类型,视力丧失是其最常见的表现。在中国,白塞氏病(Behcet disease,BD)和Vogt-小柳原田综合征(Vogt Koyanagi Harada,VKH)是葡萄膜炎类型中最常见的两种疾病。Behcet病包括了血管炎性病变导致的葡萄膜炎、复发性口腔溃疡和生殖器溃疡、多形性皮肤病变。VKH综合征属于自身免疫性疾病,最典型的特征是双眼肉芽肿性葡萄膜炎,同时还常伴有脑膜刺激征、听力下降、耳鸣、皮肤和毛发异常等。葡萄膜炎的治疗主要是应用皮质类固醇和免疫抑制药物,但是临床中发现使用上述药物具有严重的副作用,因此,阐明葡萄膜炎的发病机制对于开发更特异的药物具有重要的意义。A20是在经TNF-α处理后的脐静脉内皮细胞反应中检测到的一个诱导性表达蛋白,因此也被称为TNF-α诱导蛋白3(TNF-α-induced protein 3,TNFAIP3)。在我们团队的前期研究中已经发现A20基因中的rs9494885、rs10499194和rs7753873位点的多态性与Behcet病存在相关,其中rs9494885与Behcet病存在强相关;rs9494885位点的多态性与VKH综合征存在密切相关。因此,我们将进一步研究A20在Behcet病和VKH综合征中的发病机制。A20表达于多个免疫器官,包括胸腺、脾脏和肠相关免疫组织等。肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)是TOLL样受体信号通路中的关键分子,其泛素化调节是NF-κB活化的关键因素,A20则通过对调节TRAF6的去泛素化功能减弱NF-κB信号系统的活性,从而发挥对天然免疫反应的负性调节作用。近年来,越来越多的研究证实A20与树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)的激活、成熟及功能密切相关。因此,A20与免疫性疾病的研究也随之增加。研究表明,缺乏A20的小鼠能够自发性的激活树突状细胞及T淋巴细胞。A20fl/flCd11c-Cre小鼠能自发的形成血清阴性强直性关节炎、淋巴细胞性结肠炎和关节附着点炎。树突状细胞中A20基因的缺乏会增强细胞抗凋亡的能力,导致炎症反应的发生。然而,除了A20基因相关多态性与眼部免疫性疾病有关外,就再无相关报道。因此,我们决定研究这种蛋白在葡萄膜炎患者及正常人血液中的表达水平。由于Behcet病和VKH综合征是临床中最常见和最容易引起失明的两种葡萄膜炎类型,所有我们选择这两种疾病进行研究。为了阐明A20作用的可能机制,我们主要研究A20如何影响树突状细胞的功能情况。第一部分 A20在Behcet病与VKH综合征患者中mRNA表达水平的研究目的A20在自身免疫中发挥着重要的作用。在本研究中,我们探讨A20在Behcet病与VKH综合征患者中mRNA的表达水平及与两种疾病活动的相关性。方法选取活动期和静止期Behcet病患者、VKH综合征患者,同时选取性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。Behcet病和VKH综合征患者的诊断标准采用的是国际葡萄膜炎会议制定的诊断标准进行诊断。上述患者及健康人采用密度梯度离心分离外周血单核细胞,随后,提取PBMCs中的总RNA,将其反转录为cDNA,最后采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测PBMCs中A20 mRNA的表达水平。结果1、活动期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表达水平明显低于静止期Behcet病患者及正常人,而且活动期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表达水平明显降低。2、静止期Behcet病患者及正常人的A20比较则无明显的差异。3、活动期与静止期VKH综合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表达与正常人无明显差异。结论我们的研究表明:活动期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表达水平明显低于静止期Behcet病患者及正常人,而且活动期Behcet病患者PBMCs中A20 mRNA的表达水平明显降低。静止期Behcet病患者及正常人的A20比较则无明显的差异。以上结果说明A20的降低与Behcet病的发生及发展有密切的关系。活动期与静止期VKH综合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表达与正常人无明显差异。以上结果说明A20的降低与VKH综合征的发生没有联系。第二部分 A20在Behcet病患者DCs中mRNA表达水平的研究目的研究A20在Behcet病患者DCs中mRNA的表达水平情况及与疾病活动的相关性。方法选取活动期和静止期Behcet病患者,同时选取性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。上述患者及健康人采用密度梯度离心分离外周血单核细胞,通过磁珠分选的方法分离CD14~+T单核细胞,在培养基中加入人重组GM-CSF(100ng/ml)和人重组IL-4(50ng/ml)进行DCs诱导。最后,提取DCs总RNA,将其反转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测DCs中A20 mRNA的表达水平。结果1、活动期Behcet病患者DCs细胞中A20 mRNA的表达水平明显低于正常人,统计有差异。2、活动期Behcet病患者和静止期Behcet病患者相比,其DCs细胞中A20 mRNA表达水平降低,统计有差异。3、静止期Behcet病患者和正常人相比,其DCs细胞中A20 mRNA表达水平无明显差异。结论活动期Behcet病患者DCs细胞中A20 mRNA表达水平明显低于正常人。活动期Behcet病患者和静止期Behcet病患者相比,其DCs细胞中A20 mRNA表达水平降低,而静止期Behcet病患者和正常人相比,其DCs细胞中A20 mRNA表达水平无明显差异。这样的结果与我们前面在PBMCs中的结果是一致的。那我们现在已经明确知道,A20与DCs之间是有着紧密的联系。第三部分 A20在DCs中的功能研究目的研究A20对Behcet病患者及健康人DCs成熟度及DCs分泌炎性细胞因子的影响情况。方法选取活动期和静止期Behcet病患者,同时选取性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。采用密度梯度离心分离外周血单核细胞,并诱导成DCs。在诱导过程中,使用腺病毒按照不同的病毒感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)转染DCs。通过荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率。选取合适的MOI值,使用腺病毒转染DCs,采用流式细胞仪检测DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR,采用ELISA的方法检测DCs细胞分泌炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和IL-27的表达情况。结果1、通过带有GFP荧光基团标记的腺病毒转染DCs,使用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,结果发现,当MOI值为500时,绿色荧光蛋白的表达情况最高。2、当MOI值为500时,流式细胞仪检测转染效率为78.7%。人A20-shRNA腺病毒转染的DCs中A20呈现低表达。3、A20-shRNA腺病毒转染DCs后,对DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响。4、通过腺病毒转染的方法低表达A20,DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加,而IL-10和IL-27的水平降低,A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生。结论腺病毒能够有效的对DCs进行转染,且转染效率高。我们制备的人A20-shRNA腺病毒能够阻断A20的表达,并进行后续的研究。A20-shRNA腺病毒转染DCs后,对DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响。说明A20并不是通过对DCs细胞成熟度的影响来发挥作用。通过腺病毒转染的方法低表达A20,DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加,而IL-10和IL-27的水平降低,A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生。说明A20在Behcet病发病机制中可能是通过影响DCs分泌的炎性细胞因子起作用。第四部分 A20对共培养体系中CD4+T细胞功能的影响目的研究A20通过DCs对CD4~+T细胞的影响。方法选取活动期Behcet病患者,同时选取性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。采用密度梯度离心分离外周血单核细胞,并诱导成DCs。在诱导过程中,使用腺病毒转染DCs。LPS(100ng/ml)加入培养基中刺激24小时使其成为成熟的树突状细胞。再分离CD4~+T单核细胞,将DCs与CD4~+T细胞按照1:4共培养,通过流式细胞技术检测Th17细胞的比例。结果A20-shRNA组共培养的CD4~+T细胞中,Th17细胞所占CD4~+T细胞中的比例显著升高,有统计学意义。结论A20-shRNA组共培养的CD4~+T细胞中,Th17细胞所占CD4~+T细胞中的比例显著升高。这样的结果也说明,Th17细胞与Behcet病的发生和发展有密切的关系,A20改变引起DCs活化和功能改变,最终引起Th17细胞改变,导致Behcet病的发生和发展。A20参与Behcet病发病机制的作用通路。第五部分 A20对DCs功能影响的机制目的A20是通过何种信号通路来影响DCs的功能还不得而知。本部分研究A20对DCs功能影响的机制。方法选取活动期和静止期Behcet病患者,同时选取性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。采用密度梯度离心分离外周血单核细胞,并诱导成DCs。在DCs培养至第六天时,加入LPS(100ng/ml)刺激30分钟,使用流式细胞技术检测DCs中JNK、ERK1/2、P38的磷酸化水平。结果腺病毒转染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明显升高,具有统计学意义,而ERK1/2的磷酸化水平没有变化。结论腺病毒转染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明显升高,说明JNK及p38信号通路参与了A20对DCs的影响,A20可能通过JNK及p38信号通路影响DCs,导致Behcet病的发生和发展。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R773.9
【图文】：

动期 Behcet 病患者 PBMCs 中 A20 mRNA 的表达水平者及正常人，而且活动期 Behcet 病患者 PBMCs 中 A2低，但能够检测的出来。而静止期 Behcet 病患者及正差异（图 1-1）。

重庆医科大学博士研究生学位论文38图1-2 活动期VKH综合征患者、静止期VKH综合征患者和健康对照者PBMCs中A20 mRNA的表达水平情况Figure 1-2 Quantitative real time-PCR analysis ofA20 mRNAin PBMCs in active VKHpatients compared with inactive VKH patients and sex- and age-matched normal controlsindividuals3 讨论葡萄膜炎是指影响葡萄膜（虹膜、睫状体、脉络膜）及其邻近结构（玻璃体、视网膜、视神经、血管）的任何一种炎症过程。这种炎症过程的起源可以是内源性的，是全身性疾病的一部分或主要发生在眼部，也可以是外源性的，与任何一种影响眼球的感染因素相关，或者是发生于多系统感染。葡萄膜炎按照发生炎症的解剖部位分类，可分为前葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎 3种；按病因可将其分为感染性（细菌、病毒、真菌、寄生虫等）和非感染性（特发性、自身免疫类、创伤性、伪装综合征等）两大类。葡萄膜炎会严重威胁视力，如果不及时正确的处理，可能导致不可逆转的视力丧失。多达 35%的葡萄膜炎患者至少有一只眼出现失明或视力损害[29]。在发达国家中，葡萄膜炎是第五位引起严重视力丧失的疾病，多达 20%的法定盲是由于葡萄膜炎的并发症所引起[30]。其中 VKH 综合征和 Behcet 病是亚洲常见的两种葡萄膜炎疾病类型[31; 32]

ehcet 病患者 A20 的表达水平与正常人无中，我们已经证实活动期 Behcet 病患者 PBMC于静止期 Behcet 病患者及正常人。PBMCs 是外细胞、单核细胞、DCs 和其它少量细胞。其中 目前所知的功能最强的、唯一能激活初始性 T 胞(Antigen presenting cell, APC),是混合淋巴ion, MLR)中最强的刺激剂。DCs 已经证实在Ⅰ型、SLE、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病起重 DCs 中 A20 的表达情况。实验结果显示：活动 mRNA 表达水平明显低于正常人。活动期 Behc比，其 DCs 细胞中 A20 mRNA 表达水平降低，相比，其 DCs 细胞中 A20 mRNA 表达水平无明

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 杨培增,张震,王红,周红颜,黄祥坤,李兵;葡萄膜炎的临床类型及病因探讨[J];中华眼底病杂志;2002年04期

2 ;MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells[J];Cell Research;2002年01期

本文编号：2794373