Wnt信号通路在自身免疫性葡萄膜炎中的激活状态

发布时间：2020-08-28 07:01

【摘要】：目的自身免疫性葡萄膜炎是常见的致盲性眼病,也是常见的自身免疫性疾病。由于多累及成年工作群体,可导致沉重的社会和经济负担。该病的发病原因和发病机制尚不清楚。实验性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)动物模型与人类自身免疫性全葡萄膜炎或后部葡萄膜炎具有相似的病理过程,是研究自身免疫性葡萄膜炎的常用工具。Wnt/β-catenin信号通路与遗传、发育、增殖和分化等密切相关,在炎症过程中也发挥重要作用。研究显示,在多种自身免疫性疾病中,Wnt/β-catenin信号通路存在异常激活或抑制,但在自身免疫性葡萄膜炎中其改变状态鲜有报道。本课题采用小鼠EAU模型检测Wnt/β-catenin信号通路的激活状态,为解释自身免疫性葡萄膜炎的发病机制提供新思路,并为该病的预防及治疗提供新的靶点和途径。方法1.EAU动物模型制备:采用8-10周雌性C57BL/6小鼠,分为WT组和EAU组,每组各6只。将光感受器间维生素A类结合蛋白多肽651-670(IRBP 651-670)和含有结核杆菌H37RA的完全福氏佐剂充分乳化混合,在每只小鼠背部两侧皮下注射200μl乳剂,腹腔注射100μl白喉毒素,制备抗原主动免疫的小鼠EAU模型。2.临床观察:各组小鼠于免疫后第6天开始隔日使用间接检眼镜观察双眼眼底炎症表现,参照Caspi临床分级进行评分,同时进行小鼠眼底相干光断层成像(OCT)检查。3.小鼠视网膜组织的分离:麻醉小鼠,暴露眼球,使用弯镊快速离断视神经根部并取出眼球。在解剖显微镜下用角膜剪将眼球的角巩膜缘剪开,剥离角膜、虹膜、晶状体和玻璃体。夹住外层巩膜,轻柔地将视网膜组织从眼球中钝性分离。4.实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测参与Wnt/β-catenin通路信号激活过程的部分因子(TCF、LEF、AXIN2、MYC和Cyclin D1),分析其在视网膜中m RNA水平的表达情况。5.Western blot法检测各组小鼠视网膜中Wnt/β-catenin通路信号蛋白β-catenin和LRP6的激活情况。6.酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组小鼠血浆中Wnt/β-catenin通路抑制剂(DKK1、PDEF和Kallistatin)的表达水平。结果1.成功建立小鼠EAU模型并对眼底炎症表现进行临床评分。2.RT-PCR结果发现:TCF、LEF、AXIN2、MYC和Cyclin D1在发病后的EAU组小鼠视网膜中表达量较wild-type(WT)组小鼠均有不同程度的上调,其中TCF、AXIN2和MYC显著性上调(p0.05),LEF和Cyclin D1的表达量上调但无显著性差异。3.Western blot结果显示:EAU组小鼠发病后,β-catenin和LRP6在视网膜中的表达量均高于WT组小鼠(p0.05)。4.ELISA结果显示:Wnt信号通路抑制剂DKK1和PDEF在发病后的EAU组小鼠血浆中表达量高于WT组小鼠(p0.05),Kallistatin的表达量降低,无显著性差异。结论1.Wnt/β-catenin信号通路在自身免疫性葡萄膜炎中存在异常激活。2.Wnt/β-catenin信号通路可能成为预防和治疗葡萄膜炎的新靶点,为新型药物的研发提供新的思路。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R773
【图文】：

OCT图像,眼底,小鼠,相关因子

图 2 小鼠眼底 OCT 图像。A：WT 组小鼠的 OCT 图像视网膜正常无炎症；B、C、D：EAU 组小鼠发病后的 OCT 图像显示从发病初期至炎症高峰期，视网膜各层结构破坏逐渐加重，炎症细胞浸润逐渐增多，玻璃体腔也受到累及逐渐出现炎性细胞浸润。2.3 Wnt 信号通路相关因子 mRNA 表达水平RT-PCR 结果显示与 WT 组相比，诱导后第 12 天和第 18 天的 EAU 组小鼠视网膜组织中 Wnt/β-catenin 信号通路相关因子 TCF、LEF、AXIN2、MYC 和CyclinD1 的 mRNA 表达量均呈上调趋势，其中 TCF、AXIN2 和 MYC 显著性上调(p＜0.05)，LEF 和 CyclinD1 无显著性差异（图 3）。

小鼠,表达水平,免疫后,相关因子

11图 3 RT-PCR 检测小鼠视网膜组织中 TCF、LEF、AXIN2、MYC 和 CyclinD1 的mRNA 的表达水平。3.A：免疫后第 12 天；3.B：免疫后第 18 天。2.4 Wnt 信号通路相关因子蛋白表达水平2.4.1 Western blot 结果与对照组比较，EAU 组小鼠视网膜组织中 β-catenin 在诱导后第 18 天表达量明显上调（p＜0.05）；LRP6 在诱导后第 12 天表达量出现上调，但无显著性差异，在第 18 天表达量显著上调（p＜0.05）（图 4）。

小鼠,表达水平,浓度,血浆

图 4 Western blot 检测小鼠视网膜组织中 β-catenin 和 LRP6 的2.4.2 ELISA 结果EAU 组与 WT 组小鼠相比，血浆中 DKK1 在诱导后第 18(p＜0.05)；PEDF 在诱导后第 12 天浓度明显上升(p＜0.05)；Ka第 12 和 18 天浓度呈下降趋势，无显著性差异（图 5）。

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