螺内酯与缬沙坦对氧诱导小鼠视网膜病变新生血管抑制作用及机制的初步探讨

发布时间：2017-05-23 21:04

  本文关键词：螺内酯与缬沙坦对氧诱导小鼠视网膜病变新生血管抑制作用及机制的初步探讨，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity, ROP)是一种发生于早产儿的增殖性视网膜病变,在此病变中视网膜血管病变是导致患儿视力损害甚至失明的主要原因之一。近年来随着我国围产医学和新生儿学的快速发展,早产儿、低出生体重儿经抢救存活率明显提高,ROP的发生率也相应增加,严重影响了早产儿的生存质量,也使近年来因ROP引起的医疗纠纷呈逐年增多之势。ROP的发病机制尚未阐明,已有的研究表明发育未成熟的视网膜血管对氧极为敏感,高浓度氧使视网膜血管收缩甚至阻塞,引起视网膜细胞缺少氧气和养料供给。由于缺氧而产生促血管增生因子,从而刺激视网膜发生新生血管。ROP新生血管多发生在以颞侧为代表的视网膜的周边部,病理性新生血管由视网膜内层萌芽,并且逐渐由内而外向视网膜表面生长,甚者延伸生长入玻璃体腔内。新生血管大多伴有异常纤维组织增生,沿玻璃体前面生长的异常纤维血管膜在晶体后方形成晶体后纤维膜,一旦纤维膜收缩,则周边部视网膜被拉向眼球中心,导致牵引性视网膜脱离,最后造成不可逆性眼球萎缩、失明。因此在ROP的病理生理过程中,新生血管的形成起着主导作用。新生血管的生成是一个复杂的众多促血管生成因子之间相互作用的结果。在正常情况下,血管生成物质与抗血管生成物质达到平衡时,血管生成的过程暂停,若有病理性因素改变这一平衡,促进血管生成物质增多,则血管生成过程开启,形成新生血管。 目前对该病的治疗主要有手术治疗,如视网膜光凝、冷凝、玻璃体切割术等方法,但治疗效果不佳。基于对ROP中视网膜新生血管发病机制认识的不断深入,视网膜新生血管的药物治疗无疑成为一种颇具潜力治疗的方法,积极探索能通过作用于血管生成和炎症路径的治疗方法是早期ROP非手术治疗方法的当务之急。 肾素-血管紧张素系统(renin. angiotensin system, RAS)不仅是一个典型的内分泌系统,而且是一个自分泌与旁分泌系统,由肾素、血管紧张素及其受体组成。完整的RAS系统存在于人类和多种生物的视网膜中,并且被发现存在于发育中的视网膜内。先前研究发现血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)和血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2)在视网膜神经层和色素上皮层及葡萄膜组织中比血浆中高5-100倍,这表明眼组织中高浓度的AT1, AT2并非来源于血循环。眼组织中的RAS独立于血循环而存在,RAS大量存在于视网膜血管和内层视网膜的神经元及胶质细胞中。Kida T等发现RAS的主要成分——血管紧张素和肾素存在于视网膜无长突细胞和神经节细胞,后者还存在于Muller细胞中。肾素-血管紧张素抑制剂包括血管紧张素转换酶(angiotensin—converting enzyme, ACE)抑制剂、血管紧张素ⅡⅡ受体拮抗剂(angiotensin II receptor blockers, ARB)、醛固酮拮抗剂等,具有抗高血压、抗心衰、抗肾功能不全、抗糖尿病等多种生物学作用。近期研究发现血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂具有防止和减弱ROP视网膜新生血管病理性生成的作用,但对于醛固酮拮抗剂用于ROP视网膜新生血管的报道比较少。在醛固酮腺瘤中,血管生成量与醛固酮成正相关。在角膜微囊袋法和后肢缺血模型中,螺内酯抑制新生血管生成。醛固酮的分泌主要受肾素-血管紧张素调节,那么眼组织中是否存在MR-醛固酮系统独立的表达,在视网膜血管发育中,醛固酮可否发生着作用,这一问题尚未见相关文献报道。本实验利用氧诱导小鼠视网膜病变模型(OIR)模拟ROP,分别采用醛固酮拮抗剂螺内酯与ARB缬沙坦腹腔注射干预,通过对小鼠视网膜形态及其VEGF和MCP-1表达的观察,初步探讨其作用。在对视网膜新生血管形态的切片观察中,我们发现固定液种类繁多,必须选择一种能够较好的固定视网膜并且避免固定液性视网膜脱离的眼球固定液。现有报道的眼球固定液中多为用来观察角膜晶状体等部分,而对于视网膜的固定液未见明确报道,因此我们比较了四种已有的固定液对小鼠的视网膜固定作用。 基于以上分析,本研究主要由两部分展开,第一部分观察四种不同复合固定液对小鼠视网膜的固定效果,并进行比较分析,选择出理想的视网膜固定液,为进一步实验打好基础；第二部分在第一部分研究的基础上观察醛固酮抑制剂是否同血管紧张素Ⅱ抑制剂一样,可以抑制视网膜新生血管的形成,同时探讨其抑制作用可能的机制。 第一部分四种不同复合固定液对小鼠视网膜固定作用比较 目的 观察四种不同复合固定液对小鼠视网膜的固定效果,并进行比较分析,选择安全有效的固定液进行第二部分的实验中的视网膜固定,为视网膜的固定提供实验依据和临床应用。 方法 40只昆明小鼠随机平均分到A-D四组,腹腔过度麻醉处死后,立即摘除眼球,每组共包含10只小鼠的20只眼球。A组浸泡于固定液1(多聚甲醛4g,加入0.1mol/L磷酸缓冲液80mL,加热至60℃左右,持续搅拌,使粉末完全溶解,加少许1nol/LNaOH澄清。待溶液冷却后,,依次加冰醋酸5mL、丙酮10mL,用0.1mol/L磷酸缓冲液补足至总容量100mL)；B组使用固定液2(5%重铬酸钾40mL、10%甲醛10mL、冰醋酸10mL、三氯醋酸10mL、10%醋酸钠10mL的混合溶液)；C组浸泡于固定液3(冰醋酸10mL、40%甲醛溶液20mL、生理盐水70mL、75%酒精10mL的混合溶液)固定；D组浸泡于固定液4(无水乙醇60mL、40%甲醛溶液10mL、冰醋酸10mL、氯仿20mL的混合溶液)。固定液均没过小鼠眼球,使小鼠眼球能够得到充分浸泡。固定24小时候进行常规脱水、石蜡包埋固定、HE染色。 采用SPSS13.0统计软件,对数据进行卡方检验,P0.05为差异有统计学意义。 结果 肉眼可见A组、B组小鼠眼球可见部分视杯凹陷皱缩,不能保持原有形态；C组、D组小鼠眼球外形圆滑,色泽亮白透明,眼杯形状未见明显皱缩凹陷等变形,眼球形状基本保持原有状态。切片时,A、B组较难得出完整切片；C组所得切片结构不清晰；D组的切片较为完整。 视网膜HE染色可见A组小鼠视网膜各层组织均有不同程度断裂,部分组织结构缺失,视网膜各层组织间隙较大。组织细胞结构疏松,细胞均明显着色,细胞固缩,染色质颜色偏暗,各层颜色对比较明显；B组小鼠视网膜各层分离,组织断裂,组织缺失。视网膜各层组织结构间存在裂隙。组织细胞间龟裂变形,组织间隙增大,细胞收缩,着色加深,细胞内组织结构颜色对比不明显；C组小鼠视网膜各层组织结构较清晰,色泽可,各层组织结构完整,细胞结构较清晰,但可见固定液性视网膜分离；D组小鼠视网膜各层组织结构完整,无明显结构改变,未见视网膜的脱落和分离,眼球各层组织结构清晰无裂隙。组织细胞间无龟裂变形,无细胞过度收缩和膨胀,未见组织的自溶；细胞核仁、核膜清晰,染色质均匀,色泽亮丽,颜色对比明显。 各组间数据采用卡方检验,各组眼球收缩比有显著差异(卡方值为34.687,P0.05),各组眼球硬化比有显著差异(卡方值为34.972,P0.05),各组固定液性网脱发生比有显著差异(卡方值为49.048,P0.05) 结论 经过固定液4固定的视网膜组织可以清晰看到视网膜各层且罕见固定液性视网膜脱离。加入能与乙醇、冰醋酸互溶的氯仿能有效促进固定液的眼球渗透,降低了固定液性视网膜脱离。 第二部分螺内酯与缬沙坦对氧诱导小鼠视网膜新生血管抑制作用的观察 目的 观察螺内酯与缬沙坦对氧诱导小鼠视网膜病变模型视网膜中新生血管的抑制作用,探讨其对VEGF、MCP-1蛋白及mRNA表达变化的影响。方法 C57BL/6J新生小鼠60只,随机分为A-F六组,每组10只。A、B组新生小鼠置于正常空气环境中与其母鼠一同饲养。C、D、E、 F四组7日龄新生小鼠与其母鼠放入特定氧箱中,制造氧诱导视网膜病变模型。在日龄12-18天时,A、C组新生小鼠不做处理,B、D组新生小鼠腹腔注射溶剂2.5ml/(Kg·d),E组新生小鼠腹腔注射螺内酯25mg/(Kg·d), F组新生小鼠腹腔注射缬沙坦10mg/(Kg·d)。干预一周后取各组小鼠视网膜标本,行视网膜切片HE染色观察新生血管生长情况,利用Western-Blot和RT-PCR技术检测VEGF、MCP-1表达变化,观察其对视网膜病理性新生血管抑制作用。 采用SPSS13.0统计软件,实验测试指标的数据资料以MEAN±SD表示；对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),P0.05为差异有统计学意义。结果 视网膜HE染色可见A、B组组视网膜各层细胞整齐排列,内界膜走形平滑,不见或较少见血管内皮细胞突破内界膜；C组视网膜内界膜内可见大量血管内皮细胞,甚至可见血管内皮细胞团,血管扩张,可见玻璃体腔内新生血管及出血；D组视网膜内界膜内可见大量血管内皮细胞,甚至可见血管内皮细胞团,血管扩张,可见玻璃体腔内新生血管及出血,未见与C组形态明显不同；E组视网膜各层细胞排列较整齐,可见中等量血管内皮细胞突破内界膜；F组视网膜各层细胞排列较整齐,可见少量血管内皮细胞突破内界膜。 突破内界膜的血管内皮细胞计数：A组为3.23±2.192,B组2.7±1.915,C组49.90±4.809,D组50.17±5.140,E组25.70±3.415,F组7.20±3.478；各组间比较有统计学差异(F=1109.859,P=0.00)；两组间比较A组与B组(P=0.995),C组与D组(P=1)间未见明显统计学差异,其余各组间可见较明显统计学差异(P均0.05)。 Western blot及RT-PCR检测发现六组小鼠视网膜中均有MCP-1蛋白及mRNA的表达,且其波动呈现一致性。两指标各组间比较均有有显著性统计学意义。VEGF在正常对照组(A组、B组)视网膜中表达微弱,而在OIR模型组(C组、D组)视网膜中表达显著上调,与正常对照比较差异有统计学意义(P0.05)；E组、F组与OIR模型组比较VEGF表达下调,且F组降低较E组显著,差异有统计学意义(P0.05)。同样检测方法发现六组视网膜中均有VEGF蛋白及mRNA表达,且其波动呈现一致性。两指标各组间比较差异有统计学意义。VEGF在正常对照组(A组、B组)视网膜中表达微弱,而在OIR模型组(C组、D组)视网膜中表达显著上调,与正常对照比较差异有统计学意义(P0.05)；E组、F组与OIR模型组比较VEGF表达下调,且F组降低较E组显著,具有显著差异(P0.05)。 结论 1.小鼠视网膜中可能存在独立的肾素血管紧张素醛固酮系统； 2.螺内酯与缬沙坦均可通过抗炎、抗血管内皮细胞生长因子途径抑制氧诱导小鼠视网膜病变中病理性新生血管； 3.在本实验所使用药物剂量下,缬沙坦螺比内酯抑制视网膜新生血管的作用更强,这可能与缬沙坦不仅能够阻滞醛固酮途径抑制新生血管,亦能够阻滞血管紧张素Ⅱ的促新生血管生成作用有关。
【关键词】：螺内酯 缬沙坦 视网膜新生血管 单核细胞趋化蛋白-1 血管内皮细胞生长因子
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R774.1
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-23
• 参考文献20-23
• 第一章 四种不同复合固定液对小鼠视网膜固定作用比较23-37
• 背景内容23
• 1 实验材料23-25
• 2 实验方法25-26
• 3 实验结果26-32
• 4 讨论32-34
• 5 参考文献34-37
• 第二章 螺内酯与缬沙坦对氧诱导小鼠视网膜新生血管抑制作用的观察37-68
• 背景内容37
• 1 实验材料37-45
• 2 实验方法45-51
• 3 实验结果51-60
• 4 讨论60-65
• 5 参考文献65-68
• 全文总结与展望68-70
• 攻读学位期间成果70-71
• 致谢71-72

【参考文献】

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本文编号：389088