尾静脉注射骨髓间充质干细胞对小鼠视网膜激光损伤的治疗作用

发布时间：2017-07-20 05:03

  本文关键词：尾静脉注射骨髓间充质干细胞对小鼠视网膜激光损伤的治疗作用

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【摘要】：目的多种视网膜退行性疾病都以视网膜细胞丧失为特征,目前临床上仍缺乏有效治疗措施。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在视网膜损伤修复及神经保护方面的研究中不断体现出其独特的优势。本实验通过建立视网膜激光损伤模型,观察MSCs治疗后,损伤视网膜的形态学变化及视网膜细胞凋亡情况,并初步探讨其分子学机制,为未来临床应用MSCs治疗视网膜退行性疾病探索新的方法和理论依据。 方法 1.培养GFP-MSCs:体外培养C57BL/6小鼠绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞(green fluorescent protein labeled mesenchymal stem cells, GFP-MSCs)并进行传代,细胞爬片观察GFP表达情况。 2.制作视网膜激光损伤模型：135只C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(15只)、损伤对照组(60只)和MSCs治疗组(60只)。采用激光光凝方式建立视网膜激光损伤模型。 3.尾静脉移植MSCs:激光光凝后1天,MSCs治疗组小鼠尾静脉注射0.2mlGFP-MSCs细胞悬液(含MSCs1×106个),损伤对照组小鼠尾静脉注射等体积磷酸盐缓冲液。 4.组织病理学改变：分别于视网膜激光光凝后第3、7、14和21天,处死各组小鼠并摘除眼球,做石蜡切片。采用苏木精-伊红染色观察视网膜组织形态,并用图像处理分析软件测量激光斑直径和外核层光感受器细胞核完全缺损区域直径。 5.TUNEL法检测细胞凋亡：分别于各时点处死各组小鼠并摘除眼球,做冰冻切片。原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL)法检测视网膜细胞凋亡情况。 6.观察GFP-MSCs细胞迁移：荧光显微镜观察MSCs治疗组GFP-MSCs向视网膜内的迁移情况。 7. GFAP和MMP-2的基因表达：分别于各时点处死各组小鼠并摘除眼球,提取眼球总RNA,逆转录合成cDNA,荧光实时定量PCR检测胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)和基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)的基因表达变化。 结果 1.成功培养GFP-MSCs,GFP表达率高。 2.成功建立视网膜激光损伤模型。 3.光学显微镜下观察发现,正常对照组视网膜组织结构完整；损伤对照组及MSCs治疗组均可见视网膜组织结构损伤,但MSCs治疗组较损伤对照组损伤程度减轻。激光光凝后第3天,损伤对照组与MSCs治疗组间激光斑直径比较,差异无统计学意义(t=0.964, P0.05); MSCs治疗组外核层光感受器细胞核完全缺损区域平均直径小于损伤对照组,差异有统计学意义(t=5.769,P0.05)。激光光凝后第7、14和21天,MSCs治疗组激光斑直径(t=5.180、5.417、2.381)和外核层缺损区域直径(t=3.530、3.224、3.162)均小于损伤对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。 4.激光光凝后第3、7、14和21天,正常对照组小鼠视网膜内均未见凋亡细胞；损伤对照组及MSCs治疗组小鼠损伤部位视网膜内可见凋亡细胞。激光光凝后各时间点, MSCs治疗组平均细胞凋亡数均小于损伤对照组,差异有统计学意义(t=11.142、7.479、6.678、3.953,P0.05)。 5.荧光显微镜观察发现,激光光凝后第3、7、14和21天时未见MSCs治疗组GFP-MSCs大量向视网膜内迁移；仅于激光光凝后第7和14天时在视网膜下及脉络膜新生血管处有少量迁移。 6.FQRT-PCR结果显示,激光光凝后第14和21天时GFAP的mRNA水平低于损伤对照组(t=2.481、2.562,P0.05),第7、14和21天时MMP-2的mRNA水平低于损伤对照组(t=2.466、4.687、4.001,P0.05)。 结论尾静脉注射MSCs能有效抑制激光损伤后的视网膜细胞凋亡,减轻小鼠视网膜激光损伤后的炎症反应,改善视网膜组织结构,限制损伤向周围组织蔓延。
【关键词】：视网膜 激光损伤 间充质干细胞 细胞凋亡 GFAP MMP-2
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R774.1
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-17
• 1. 实验材料和方法17-26
• 1.1 实验材料17-18
• 1.2 实验方法18-26
• 2. 实验结果26-36
• 2.1 GFP-MSCs的培养和细胞爬片26-27
• 2.2 MSCs治疗后的视网膜形态结构变化27-32
• 2.3 GFP-MSCs对视网膜激光损伤后细胞凋亡的影响32-35
• 2.4 MSCs向视网膜内迁移情况35
• 2.5 FQRT-PCR检测GFAP和MMP-2的基因表达35-36
• 3. 讨论36-44
• 结论44-45
• 参考文献45-52
• 发表论文和参加科研情况说明52-53
• 综述53-64
• 综述参考文献61-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 杨秀梅;王雨生;;脉络膜新生血管的动物模型[J];国际眼科纵览;2006年03期

2 李涛,罗清礼,吴海英;激光光凝后视网膜组织光镜观察和免疫组织化学研究[J];四川大学学报(医学版);2004年04期

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本文编号：566316