EB病毒Zta-P54蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及检测方法的初步探索

发布时间：2017-08-22 11:38

  本文关键词：EB病毒Zta-P54蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及检测方法的初步探索

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【摘要】：EB病毒与鼻咽癌的发生密切相关，该病毒以环状DNA的形式整合在宿主细胞染色体上。由于鼻咽位置较深，早期病变在临床常规体检中不容易被发现，且CT等影像学诊断很难区分早期鼻咽癌与其它鼻咽增生性病变。因此，创伤小、成本低、检测速度快的血清学诊断方法是目前鼻咽癌早期诊断研究的热点和难点。鉴于此我们拟通过表达鼻咽癌BZLF1-BMRF1融合基因的蛋白抗原来建立检测病人血清中EB病毒相关抗体，为鼻咽癌的早期诊断及广谱筛查提供技术手段。 本研究根据本实验室pGEX5T-BZLF1-BMRF1质粒的测序结果，利用premer5.0设计引物，从已有EB病毒抗原基因序列的质粒上，通过PCR方法扩增获得目的基因片段，与载体pET32a连接，构建重组质粒pET32a/BZLF1-BMRF1，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析蛋白可溶性、Western blot检测所表达蛋白的免疫原性，并通过优化的硫酸铵沉淀、离子交换层析和亲和层析对重组蛋白进行纯化。辣根过氧化物酶标记纯化的Zta-P54融合蛋白，利用棋盘法确定重组抗原包被和酶标抗体工作浓度，初步建立新的鼻咽癌诊断及筛查ELISA方法，对其进行特异性、精密性和临床分析。结果表明：1）成功构建重组质粒pET32a/BZLF1-BMRF1实现了Zta-P54融合蛋白的可溶性表达；2）建立了该抗原的优化纯化程序，纯度可达96.5%；3）利用所表达蛋白初步建立了鼻咽癌ELISA间接检测方法与临床诊断结果符合率较高，有望用于鼻咽癌前期辅助诊断及大规模筛查，同时，为鼻咽癌特异性血清学诊断方法的建立提供了借鉴。
【关键词】：EB病毒 鼻咽癌 Zta-P54融合蛋白 原核表达 蛋白纯化 ELISA检测
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63;Q78
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 符号说明10-12
• 1 文献综述12-22
• 1.1 课题背景12
• 1.2 形态学特点及分子结构12-14
• 1.2.1 形态学特点12-13
• 1.2.2 EB 病毒的分子结构13-14
• 1.3 EB 病毒的感染与增殖14
• 1.4 EB 病毒基因组的转录与表达14-16
• 1.4.1 BZLF1 基因和其表达蛋白15-16
• 1.4.2 BHRF1 与 BALF1 基因16
• 1.5 EB 病毒与相关疾病16-19
• 1.5.1 肿瘤性疾病17
• 1.5.2 慢性活动性 EB 病毒感染（CAEBV）17
• 1.5.3 EB 病毒与鼻咽癌的发生17-19
• 1.5.4 EB 病毒与其他相关疾病19
• 1.6 检测的方法19-21
• 1.6.1 直接检测 EBV 基因组或其表达产物19-20
• 1.6.2 EBV 血清学检查20
• 1.6.3 EB 病毒分子生物学诊断方法20-21
• 1.7 本课题的目的和意义21
• 1.8 本课题的创新点21-22
• 2 材料和方法22-51
• 2.1 实验材料22-35
• 2.1.1 载体与受体菌22-23
• 2.1.2 血清23
• 2.1.3 主要仪器与设备23-24
• 2.1.4 主要试剂24-25
• 2.1.5 主要溶液的配制25-35
• 2.2 方法35-51
• 2.2.1 Zta-P54 融合抗原的克隆与鉴定35-39
• 2.2.2 重组蛋白抗原片段的表达、纯化、鉴定39-46
• 2.2.3 间接 ELISA 方法的初步建立46-51
• 3 实验结果与分析51-65
• 3.1 EBV 基因的扩增和重组质粒的构建51-52
• 3.1.1 PCR 扩增目的基因片段51
• 3.1.2 重组质粒的双酶切鉴定51-52
• 3.1.3 测序鉴定52
• 3.2. 重组蛋白的诱导表达、纯化、鉴定52-60
• 3.2.1 初步诱导表达优化52-54
• 3.2.2 重组蛋白的 Western Blot 鉴定54-55
• 3.2.3 重组菌诱导条件的优化55-57
• 3.2.4 蛋白的大样诱导及纯化57-59
• 3.2.5 重组蛋白 Zta-P54 浓度的测定59-60
• 3.3 间接法的初步建立60-65
• 3.3.1 质控品建立60
• 3.3.2 包被条件的优化60-63
• 3.3.4 反应时间的确定63
• 3.3.5 样本加样量确定63-64
• 3.3.6 血清标本检测64
• 3.3.7 板内精密性试验64-65
• 4 讨论65-68
• 4.1 目的基因片段的选择65
• 4.2 表达载体选择和表达条件的优化65-66
• 4.3 重组抗原纯化方法的选择66
• 4.4 基因工程抗原的优势66-67
• 4.5 ELISA 检测方法的选择67
• 4.6 未来的工作67-68
• 5 结论68-69
• 参考文献69-74
• 致谢74-75
• 附录75-79
• 个人简历79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：718961