Orexin和组胺对舌下神经运动神经元的调节作用及其内在机制

发布时间：2017-08-22 15:25

  本文关键词：Orexin和组胺对舌下神经运动神经元的调节作用及其内在机制

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【摘要】：[背景]阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome, OSAHS)是一种发病率极高的睡眠呼吸障碍性疾病,以上呼吸道的反复塌陷和慢性间歇低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)为特征。OSAHS患者正常睡眠节律严重破坏,睡眠中出现反复的觉醒。OSAHS的发病机制与睡眠时颏舌肌张力的下降有关,特别是在REM睡眠时颏舌肌的张力降至最低。颏舌肌是调节上呼吸道开放最重要的肌肉,由位于舌下神经运动核(hypoglossal motor nucleus, HMN)中的舌下神经运动神经元(hypoglossal motoneurons, HMs)发出的舌下神经主干支配。HMs接受很多的神经调节因子支配,其中有一些的作用已经完全探明,而且被证明对HMs的兴奋性特别重要,但还有很多调节因子作用不明,因此,OSAHS的中枢调控机制还不明了,药物治疗也没有获得成功。在这其中,orexin和组胺是两种非常重要的睡眠觉醒调节因子。Orexin,包括来自同一前体物质prepro-orexin (PPO)的两个单体orexin A和orexin B,主要通过与两个G蛋白偶联受体orexin受体1(OX1R)和orexin受体2(OX2R)发挥作用。大量研究证明,orexin在很多生理功能中发挥重要作用,例如饮食、能量代谢、情绪、压力反应以及心血管功能等等。不仅如此,orexin还是大脑中最重要的促觉醒物质之一,因此其可能与OSAHS患者夜间反复发生的觉醒有关。Orexin神经元主要局限性的分布于外侧下丘脑,但其神经纤维却广泛的分布于全脑,对HMN中也有投射。而且OX1R和OX2R均在HMN中有表达。之前的研究表明,orexin可能与OSAHS密切相关,但OSAHS对orexin系统的影响及orexin对OSAHS的调控作用均没有得到明确的研究。与orexin一样,组胺在中枢神经系统内发挥众多的生理功能,包括调节睡眠觉醒周期、能量和内分泌代谢和运动控制等等。组胺能神经元局限性的分布于结节乳头核,但几乎对全脑都有投射,包括延髓和HMN。组胺在大脑中有三种受体,组胺受体1(H1R)、组胺受体2(H2R)和组胺受体3(H3R),其中H1R在HMN中被发现有大量的表达。体内研究发现,在HMN中微注射组胺能增加颏舌肌的张力,但目前还没有一个研究探明组胺对HMs的调控作用及其机制的研究。[目的]探明CIH对orexin的影响及其orexin和组胺对HMs的调控作用,不仅有利于完善OSAHS的中枢调控机制,而且有利于寻找OSAHS治疗的新靶点,为未来OSAHS的药物治疗提供基础。因此,本研究旨在通过间歇低氧舱和膜片钳技术,深入研究：(1)CIH对大脑orexin系统的影响,从而探明orexin在OSAHS患者夜间觉醒中所扮演的作用；(2)Orexin对HMs兴奋性的调控作用和具体机制,从而探明orexin反向对OSAHS的调节作用；(3)探明组胺对HMs兴奋性的调控作用和具体机制,完善OSAHS的中枢调控机制。首先,本研究第一部分采用间歇低氧和膜片钳电流钳的方法,研究orexin和OSAHS相互影响。本研究的第二部分将结合电压钳和电流钳的方法,深入研究组胺对HMs的调控作用,及其受体机制、信号传导过程和离子机制。[方法]1.采用自制的CIH动物舱,通过控制舱内氧气和氮气的流量,使得每一次缺氧循环时间为lmin,氧气浓度循环于6%-21%之间,将40只大鼠随机分为5组,每组8只,分别为IH 1周组、IH 5周组、复氧组和两个对照组,将IH组置于动物舱给予间歇低氧,每天8小时,每周7天。复氧组前35天处理同CIH组,第36天起舱内输入空气,每天8小时,持续5周。两个对照组均输入空气,其余条件与IH组相同,分别持续1周和5周(IA1周和IA5周组)。实时荧光定量PCR (Real-time PCR, RT-PCR)监测大脑下丘脑PPO、下丘脑和延髓OX1R和OX2R mRNA的表达水平。2.采用国际通气的膜片钳技术,将出生约6-10天的大鼠幼崽HMN切成含成活HMs的急性脑片,通过电流钳记录和分析系统研究orexin A对HMs发放速率和膜电位的影响,及其OX1R和OX2R受体拮抗剂对orexin A效应的影响。3.采用膜片钳技术中的电流钳和电压钳技术,将出生约10-16天的大鼠幼崽的HMN切成含成活HMs的急性脑片,记录和分析组胺对HMs的调控作用,及其受体机制、信号传导过程和离子机制。[结果]1.CIH上调下丘脑PPO的表达水平,复氧能有效逆转这种上调RT-PCR结果显示,与对照组相比,间歇低氧1周能显著降低下丘脑PPOmRNA的表达水平(相对分光度为0.49±0.11 vs.1.00±0.15,P0.05)。与1周不同,间歇低氧5周后下丘脑PPO mRNA的水平达到对照组的2.1倍(P0.05)。8只经过5周CIH的大鼠再经5周复氧后,PPO mRNA的表达水平与5周对照组没有明显的差异(相对分光度为1.32±0.09 vs.1.00±0.12,P0.05)。然而,复氧组与CIH组相比差异明显(P0.05)。2.CIH增加下丘脑和延髓orexin受体的表达下丘脑是觉醒控制的重要区域,而延髓是HMN的所在地,与OSAHS密切相关。RT-PCR结果显示,1周的IH不能改变下丘脑和延髓OX1R mRNA的表达,但是与1周对照组相比,其明显增加延髓OX2R的表达。当IH时间增长到5周时,下丘脑和延髓中的OX1R和OX2R都出现明显的上升。其中,OX2R在延髓的平均表达水平达到对照的4.5倍,OX1R在延髓的平均表达水平也达到2.41倍。5周的复氧后,下丘脑OX1R和OX2R mRNA水平上升明显得到逆转,与IA5周组无明显差异。复氧后延髓OX2R的表达水平依然高于对照的IA 5周组(P0.05),但也明显低于CIH组(P0.05)。3. Orexin A增加HMs的发放速率并使其膜去极化全细胞膜片钳记录显示,胞外灌流液中加入orexin A (4-500 nM),能显著的增加HMs的发放速率并使HMs膜去极化。这种兴奋效应具有剂量依赖性,4nM、 20nM、100nM和500 nM的orexin A分别使HMs的发放速率增加108.75%±0.42%(P0.05,与control对比,n=7)、148.45±6.01%(P0.05,n=13),203.95±9.18(P0.05,n=16)和310.91±18.19%(P0.05,n=9)；4nM、20nM、100nM和500 nM的orexin A分别使HMs的膜电位去极化1.00±0.13 mV(n=7)、3.98±0.46 mV(n=13)、7.27±0.72 mV(n=16)和16.72±1.49 mV(n=9)。4.OX1R和OX2R共同介导orexin A对HMs的兴奋作用胞外灌流液中预先加入TTX(1μM)并不能拮抗orexin A的去极化作用,说明orexin A的作用是直接的突触后膜效应。胞外液预先加入orexin 1受体拮抗剂SB 334867(10 μM), orexin A (100 nM)引起的发放增加明显减弱(174.08±4.72%vs.203.95±9.18%,P0.05,n=7)。同样,预先加入orexin 2受体拮抗剂TCS OX229(10 μM)后, orexin A (100 nM)引起的发放增加作用也明显减弱(136.43±3.83 vs.203.95±9.18%,P0.05,n=7)。不仅如此,两个拮抗剂均能分别拮抗orexin A的去极化作用。当SB 334867和TCS OX229合用时,oreixn A不仅不能增加HMs的发放速率,而且不能引起膜去极化。说明OX1R和OX2R共同介导了orexin A的作用。5.组胺引起内向电流从而使HMs膜去极化,并且有脱敏作用电流钳记录显示,胞外灌流液中加入组胺(3-100 μM)能引起HMs的膜去极化。这种去极化效应具有剂量依赖性,3μM、10 μM、30μM和100μM的组胺分别使HMs去极化1.13±0.09 mV(n=9)、2.96±0.24mV(n=10)、7.26±0.33 mV(n=13)和12.29±1.10 mV(n=9)。但如果给同一个细胞或同一块脑片灌流两次组胺后发现,第二次给药引起的去极化较第一次减少(3.17±0.43 mV vs.7.60±0.35mV,P0.05,n=9),说明组胺的效应具有脱敏。电压钳显示,组胺使HMs去极化的原因是产生了一个内向电流。6.H1R介导了组胺对HMs的兴奋作用TTX不能拮抗组胺的去极化作用,TTX、bicuculline、APV和CNQX共同作用不能拮抗组胺产生的内向电流,说明组胺的效应是一种直接的突触后膜效应。在组胺H1受体拮抗剂pyrilamine (30μM)存在的情况下,组胺(30 μM)并不能使HMs的膜去极化。但在H2受体拮抗剂cimetidine (30μM)存在的情况下,组胺(30μM)依旧能使HM去极化(7.10±0.22 mV, n=7 vs.7.26±0.33 mV, P0.05)。H1受体的特异性激动剂2-(2-吡啶基)乙胺(2-pyridylethylamine,2-PyEA)能很好的模仿组胺的作用,但H2受体的特异性激动剂dimaprit和组胺H3受体的特异性激动剂r-α-methylhistamine均没有明显作用。说明只有组胺H1受体介导了组胺的作用。7.组胺效应的具体信号传导过程在ACSF中预先加入PKA和PKC的抑制剂H-89(10μM)和chelerythrine(10 μM),2-PyEA依然产生明显的内向电流(P0.05)。但预先加入PLC-IP3抑制剂U-73122(10 μM)后,2-PyEA并不能引起内向电流,说明组胺作用的信号通路为H1R/G9/11/PLC/IP3/Ca2+,PKA和PKC在其中没有作用.8.组胺的作用依赖于膜内钙离子和膜外钠离子钾离子通道的广谱拮抗剂Ba2+(4 mM BaCl2)并不能拮抗2-PyEA的作用(p0.05),HCN的拮抗剂ZD 7288(50μM)也不能拮抗2-PyEA的作用。但在Tris-ACSF或无钙电极内液中,2-PyEA(30μM)引起的内向电流明显减少(P0.05),分别为8.11±4.38 pA(n=7)和36.93±5.49 pA(n=6)。说明组胺和2-PyEA的作用不依赖钾离子和HCN离子通道,只依赖于胞外钠离子和胞内钙离子浓度,可能通过钠钙交换体的作用引起内向电流并最终导致膜去极化。[结论]CIH能不仅能显著增高下丘脑orexin前体的表达,并且能明显增加下丘脑和延髓orexin受体的表达水平；反之,orexin可以通过OX1R和OX2R调节HMs的兴奋性,因此可以推测orexin在OSAHS的睡眠片段化和OSAHS的病理生理过程中发挥重要调控作用。组胺也可调节HMs的兴奋性从而在OSAHS的中枢调控中发挥作用,其具体信号通路为Gq/11/PLC/IP3/Ca2+传递信号,最终可能激活钠钙交换体,引起内向电流,使HMs膜去极化。Orexin和组胺的研究致力于完善OSAHS的中枢调控机制,希望为OSAHS的药物研究建立一定的基础。
【关键词】：阻塞性睡眠呼吸暂停通气综合征 慢性间歇低氧 发病机制 药物治疗 Orexin A OX_1R OX_2R 组胺 2-PyEA 信号通路 离子机制
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R766
【目录】：

• 中英文缩写一览表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 第一部分16-42
• 前言16-18
• 材料18-20
• 方法20-25
• 实验结果25-35
• 讨论35-37
• 生理意义37-38
• 参考文献38-42
• 第二部分42-68
• 前言42-44
• 材料与方法44-48
• 实验结果48-59
• 讨论59-62
• 研究意义62-64
• 参考文献64-68
• 文献综述68-78
• 参考文献75-78
• 在学期间发表和待发表的文章78-79
• 致谢79-80

【共引文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 李博;五步蛇毒致大鼠海马组胺受体基因表达变化与学习记忆功能障碍的关系研究[D];重庆师范大学;2006年

2 徐宇;非咪唑类H_3受体拮抗剂的设计、合成及活性研究[D];浙江大学;2008年

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本文编号：719894