糖尿病大鼠玻璃体腔移植不同浓度人脐带间充干细胞的实验研究

发布时间：2017-09-08 19:09

  本文关键词：糖尿病大鼠玻璃体腔移植不同浓度人脐带间充干细胞的实验研究

  更多相关文章： 糖尿病视网膜病变 人脐带间充质干细胞 神经生长因子 干细胞治疗

【摘要】：目的 观察玻璃体腔移植不同浓度人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells, hUCMSCs)后糖尿病(diabetes mellitus, DM)大鼠视网膜功能变化及视网膜神经生长因子(nerve growth factor, NGF)的表达情况,观察比较移植不同浓度hUCMSCs对糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)治疗的疗效差异,进一步证明治疗DR的最佳hUCMSCs浓度,探讨hUCMSCs治疗DR的可能机制。 方法 健康成年雄性SD大鼠48只,随机分成正常对照组(A组)和DM组,分别为10、38只。链脲佐菌素(streptozocin, STZ)尾静脉注射制作SD大鼠DR模型。将DM组大鼠随机分为DR组(B组)、玻璃体腔注射高浓度(1*10^,6～7)hUCMSCs2μL组(C组),玻璃体腔注射低浓度(1*10^5～6)hUCMSCs2μL组(D组),玻璃体腔注射安慰剂2μL组(E组)。正常对照组(A组,10只)和B组无处理。成模后每2-4w进行血糖监测。用溴化乙锭(Evans blue, EB)染色视网膜铺片,荧光显微镜观察视网膜血管的变化情况：苏木精-伊红(HE)染色,光学显微镜下观察视网膜形态学变化；免疫组织化学法观察视网膜NGF阳性染色的情况,Image-Pro Plus6.0图像处理分析软件分析各组染色区的平均累积光密度(integrated optic density, IOD);用实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测视网膜中NGF mRNA的相对表达量。采用SPSS17.0统计软件,组间数据比较采用独立样本t检验、单因素方差分析、LSD-t检验进行统计学分析,P0.05为差异具有统计学意义。 结果 1.血糖水平监测：STZ尾静脉注射一周后,测得正常对照组大鼠平均血糖值为(5.43±0.81) mmol/L,糖尿病组大鼠血糖值为(27.59±3.56) mmol/L.在不同时间点测得DM大鼠血糖水平较高,但基本保持在一个稳定水平；与同期正常对照组大鼠相比差异均有统计学意义(P均0.01) 2.体质量监测：大鼠造模成功时体质量于正常对照组大鼠相似,二者比较差异无统计学意义(t=0.805,P=0.433)。造模成功后正常对照组大鼠随着周龄的增加体质量增长较快,DM大鼠体质量增长速度较正常对照组减缓,周龄越长,体质量相差越大,不同时间点测得两组体质量差异均有统计学意义(P均0.01)。 3.EB染色视网膜铺片：A组正常大鼠视网膜血管走形良好,血管管壁平滑,视网膜浅层大血管及深层血管网均清晰可见,未见视网膜微血管瘤和视网膜新生血管形成。DM大鼠视网膜血管走形迂曲、扩张,视网膜上可见微动脉瘤,血管呈串珠样改变,血管周围可见高荧光渗漏及周边视网膜可见大片无灌注区。 4.HE染色：A组正常大鼠视网膜各层结构整齐分明,细胞形态基本正常。内界膜完整清晰；神经纤维层(nerve fiber layer, NFL)较稀疏呈水平排列；神经节细胞层(ganglion cell layer, GCL)排列整齐,胞核较大,呈圆形或椭圆形,染色较淡；内丛状层(inner plexiform layer, IPL)较厚,呈较明显的网状结构；内核层(inner nuclear layer, INL)细胞胞核较大,染色稍深；外从状层(outer plexiform layer, OPL)比内从状层偏薄；外核层(outer nuclear layer, ONL)由多层细胞排列组成,染色深排列紧密；光感受器细胞层(photoreceptor cell layer,PRL)内外节形态规整。B组、E组大鼠视网膜各层细胞结构排列紊乱,节细胞等各层细胞数减少,内界膜不完整,视网膜血管内皮细胞增殖,新生血管芽呈垂直状突破内界膜生长,出现早期新生血管(neovascularization, NV)表现。C组、D组各层细胞结构排列较紊乱,各层细胞数目相对较少,可见内界膜局部不完整。 5.免疫组织化学染色：A组：NGF表达呈阳性,阳性细胞边界较清晰,主要位于视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)层, IPL、OPL、外界膜、色素上皮层,INL和ONL仅有少量表达。B、E组：2W时NGF表达呈阳性,各层表达量增加,阳性着色较深。4W时NGF阳性表达开始减弱,各层表达量减少。8W时NGF阳性表达显著减少,各层阳性染色均较浅。C、D组：2W时NGF表达增多,随着时间的推移,NGF阳性表达逐渐增强,8W时达到高峰,C组更为明显,染色更深。 6. RT-PCR检测视网膜NGF mRNA的相对表达量：2w时4个DR组间视网膜NGF mRNA表达差异无显著性(F=0.163,P=0.920),其他时间点相比差异均具有显著性(F=13.737,25.060,123.277, P均为0.000)。4w、6w、8w时B组与E组NGF mRAN相比差异无显著性(P=0.703,P=0.801,P=0.819),与C组、D组相比差异具有显著性(P0.05)。4w、6w时C组、D组相比差异无显著性(P=0.542,0.801),8w时C组与D组相比差异有显著性(P0.05)。 结论 1.STZ诱导的DM大鼠,是模拟糖尿病视网膜病变的一种可靠的动物模型； 2.DR早期即会对视网膜各层细胞造成损伤； 3.DR早期引起NGF的表达升高,随着时间的推移NGF表达呈下降趋势,视网膜神经功能减退； 4.玻璃体腔注射hUCMSCs可改善DR视网膜功能,增加NGF的表达,改善视网膜功能； 5.高浓度hUCMSCs对DR的保护效果要优于低浓度hUCMSCs的效果。
【关键词】：糖尿病视网膜病变 人脐带间充质干细胞 神经生长因子 干细胞治疗
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R774.1;R587.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 目录10-12
• ~.略语12-14
• 前言14-18
• 研究现状、成果14-17
• 研究目的、方法17-18
• 对象和方法18-29
• 1 对象18-20
• 1.1 实验动物18
• 1.2 主要仪器设备18-19
• 1.3 主要试剂19-20
• 1.4 主要实验试剂的配制20
• 2 方法20-29
• 2.1 建立动物模型20-21
• 2.2 动物分组21
• 2.3 EB染色视网膜铺片21-22
• 2.4 玻璃体腔注射22-23
• 2.5 石蜡切片及HE染色及免疫组织化学法检测NGF蛋白的表达23-24
• 2.6 免疫组织化学法检测NGF蛋白的表达(SP法)24-25
• 2.7 RT-PCR检测视网膜NGF mRNA的表达25-28
• 2.8 统计学分析28-29
• 结果29-42
• 1 DM大鼠全身情况29-32
• 1.1 实验大鼠一般情况29-30
• 1.2 分组30
• 1.3 血糖及体质量变化30-32
• 2 EB染色视网膜铺片32-33
• 3 大鼠视网膜HE染色切片观察33-34
• 4 免疫组织化学法检测视网膜NGF蛋白的表达变化34-39
• 5 RT-PCR检测视网膜NGF mRNA的相对表达量39-42
• 5.1 RNA纯度鉴定39
• 5.2 RNA完整性鉴定39
• 5.3 RT-PCR检测视网膜NGF mRNA的表达39-42
• 讨论42-48
• 1 动物模型的建立42
• 2 DM早期组织病理学变化42-43
• 3 NGF在DR中的作用43-45
• 4 移植途径45-46
• 5 hUCMSCs治疗DM造成的神经退行性改变的可能性46-47
• 6 hUC-MSCs移植浓度的选择47-48
• 结论48-49
• 参考文献49-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-54
• 综述54-64
• 综述参考文献60-64
• 致谢64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 宋鄂,吕成芳,齐晓同,董宇,王心蕊,吴家祥;糖尿病大鼠视网膜病理模型的建立[J];吉林大学学报(医学版);2003年03期

2 盛晓蓉;糖尿病大鼠建模观察[J];九江医学;1998年01期

3 康强军;刘长安;王江泳;王保芝;;不同密度骨髓间充质干细胞移植对家兔股骨头缺血性坏死的治疗作用[J];解剖科学进展;2010年01期

4 靳秋分;丁淑华;;糖尿病性视网膜病变的相关危险因素分析及治疗近况[J];中医学报;2013年01期

，

本文编号：815792