siRNA沉默葡萄糖调节蛋白78增强人鼻咽癌细胞对顺铂及放疗的敏感性

发布时间：2017-09-14 17:07

  本文关键词：siRNA沉默葡萄糖调节蛋白78增强人鼻咽癌细胞对顺铂及放疗的敏感性

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【摘要】：目的： 1.探讨顺铂（cisplatin，DDP）及电离辐射（ionizingradiation，IR）对鼻咽癌细胞株增殖抑制及诱导凋亡的影响。 2.探讨小干扰RNA(Small-interferenceRNA，siRNA)下调葡萄糖调节蛋白78(glucoseregulatedprotein78，GRP78)对鼻咽癌细胞增殖抑制及凋亡的影响。 方法： 1.MTT法探讨DDP(2，4，8，16，32μM)、IR(2，4，6，8，10Gy)处理人鼻咽癌细胞HNE1，HNE1/DDP24、48h后对细胞存活率的影响，以明确其剂量-效应关系； 2.PI单染，PI/AnnexinV双染及线粒体膜电位JC-1流式检测DDP（6μM）、IR（4Gy）对人鼻咽癌细胞诱导凋亡的影响； 3.Westernblot法探讨DDP（6μM）处理人鼻咽癌细胞HNE1，HNE1/DDP6、16、24h后对人鼻咽癌细胞中内质网应激相关蛋白GRP78表达的影响以及探讨IR(2，4，6，8，10Gy)处理人鼻咽癌细胞HNE1，HNE1/DDP24h后对GRP78表达的影响； 4.siRNA法下调GRP78后，MTT法检测细胞的存活率，Westernblot法检测鼻咽癌细胞中GRP78及其他凋亡蛋白的表达，PI/AnnexinV双染检测细胞凋亡的影响； 结果： 一、鼻咽癌细胞HNE1/DDP对DDP具有耐药性 1.MTT法显示：4μMDDP作用于人鼻咽癌细胞HNE1/DDP、HNE124、48h后细胞存活率分别为92.8%、60.13%、和85.68%、49.34%。HNE1/DDP的IC50=24.96，HNE1的的IC=6.3，RI=6.96。 2.6μMDP刺激人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP24h后，PI/AnnexinV流式检测，诱导人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分别为23.4%和10.1%，与阴性对照组比较有统计学意义；PI流式检测，诱导人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分别为11.4%和6.6%，与阴性对照组比较有统计学意义；线粒体膜电位JC-1检测，人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP的平均荧光强度（红光的平均荧光强度/绿光的平均荧光强度）为3.05、1.89，与阴性对照5.15、2.02相比，有统计学意义。 3.经6μMDDP处理人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP6、16、24h后，Westernblot法检测了凋亡蛋白Caspase-3在HNE1中自16h起出现剪切，而在HNE1/DDP没有出现剪切。 二、鼻咽癌细胞HNE1/DDP对IR具有放射耐受性 1.MTT法显示：4GyIR作用于人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP24、48h后细胞存活率分别为77.3%、89.5%和85.8%、93.0%。 2.4GyIR处理人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP24h后，PI/AnnexinV流式检测，诱导人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分别为30.4%和12.4%，与阴性对照组比较有统计学意义；PI流式检测，诱导人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP的凋亡率分别为28.1%和15.9%，与阴性对照组比较有统计学意义；线粒体膜电位JC-1检测，人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP的平均荧光强度（红光的平均荧光强度/绿光的平均荧光强度）为2.68、1.34，与阴性对照5.15、2.02相比，有统计学意义。 三、DDP具有上调鼻咽癌细胞GRP78的表达的作用 经6μMDDP处理人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP6、16、24h后，用Westernblot法检测了人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP内质网应激反应的标志蛋白GRP78的表达，在HNE1/DDP中呈时间依赖性上调，自6h起逐渐升高，24h达到高峰，但在HNE1中上调趋势不明显。 四、IR具有上调鼻咽癌细胞GRP78的表达的作用 经2、4、6、8、10GyIR处理人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP24h后，Westernblot法检测了人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP内质网应激反应的标志蛋白GRP78的表达，在HNE1/DDP中呈剂量依赖性上调，自2Gy起逐渐升高，10Gy达到高峰，但在HNE1中上调趋势不明显。 五、下调GRP78具有增强鼻咽癌细胞HNE1/DDP对DDP及IR的敏感性 1.将不同序列的siRNA-GRP78和空质粒转染进入鼻咽癌细胞HNE1/DDP中，用Westernblot法检测了鼻咽癌细胞HNE1/DDP中GRP78的表达，与对照转染空质粒组相比，转染siRNA-GRP78组中GRP78表达明显降低。 2.将鼻咽癌细胞HNE1/DDP进行转染后，MTT法显示，与对照转染空质粒组相比，转染siRNA-GRP78组中，鼻咽癌细胞HNE1/DDP的存活率明显下降，说明GRP78在鼻咽癌细胞HNE1/DDP中具有保护作用。 3.将鼻咽癌细胞HNE1/DDP进行转染后，PI/AnnexinV流式检测，与对照转染空质粒组相比，转染siRNA-GRP78组中，鼻咽癌细胞HNE1/DDP的凋亡率明显上升，说明GRP78在鼻咽癌细胞HNE1/DDP中具有保护作用。 4.将鼻咽癌细胞HNE1/DDP进行转染后，PI/AnnexinV流式检测单用DDP组、IR组、下调GRP78与DDP合用组，下调GRP78与IR合用组，后者的凋亡率明显升高，与单用DDP组、IR组相比，具有统计学意义。 5.将鼻咽癌细胞HNE1/DDP进行转染后，Westernblot方法检测下调GRP78后，促凋亡蛋白Bax、Bak、Puma表达上调和抑凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达下调。 结论： 1.DDP、IR对人鼻咽癌细胞HNE1、HNE1/DDP具有增殖抑制作用，，且随着照射剂量和DDP浓度的加大和作用时间的延长，细胞存活率随之降低，但HNE1/DDP细胞对DDP、IR诱导的增殖抑制及凋亡不敏感。作用机制可能与DDP、IR诱导的内质网应激关键蛋白GRP78的保护作用相关。 2.DDP、IR诱导后，HNE1/DDP中GRP78的表达明显增加，而在HNE1中GRP78没有明显上升趋势。作用机制可能与GRP78的保护作用有关，由此产生了耐药。 3.下调GRP78后，HNE1/DDP的细胞存活率明显下降，凋亡率明显上升，抑凋亡蛋白表达下调，促凋亡蛋白表达上调，由此证明GRP78在鼻咽癌细胞HNE1/DDP的保护作用。
【关键词】：鼻咽癌 DDP IR siRNA 内质网应激 凋亡
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 引言11-12
• 材料与方法12-24
• 1. 材料与仪器12-14
• 2. 实验方法14-23
• 2.1 细胞培养14-15
• 2.2 X 射线照射方法15
• 2.3 MTT 法检测细胞存活率15-16
• 2.4 PI/AnnexinV 双染法检测细胞凋亡16-17
• 2.5 PI 单染法检测细胞凋亡17-18
• 2.6 线粒体膜电位检测细胞凋亡18-19
• 2.7 siRNA 转染19-20
• 2.8 免疫印迹法检测相关蛋白的表达20-23
• 3. 统计学处理23-24
• 结果24-34
• 1 鼻咽癌细胞 HN1/DDP 对 DDP 具有耐药性24-27
• 2 鼻咽癌细胞 HNE1/DDP 对IR 具有放射耐受性27-30
• 3 DDP具有上调鼻咽癌细胞 GRP78 的表达的作用30-31
• 4 DDP具有上调鼻咽癌细胞 GRP78 的表达的作用31
• 5 下调 G RP 78 具有增强鼻咽癌细胞 HNE1/DDP 对 DDP及IR 的敏感性31-34
• 讨论34-38
• 结论38-39
• 参考文献39-42
• 致谢42-43
• 附录43-56
• 附录A 英中文术语缩略语对照表43-44
• 附录B 主要试剂配制方法44-47
• 附录C 个人简历及发表论文47-48
• 附录D 综述48-56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 Malcolm J. Simons;;Nasopharyngeal carcinoma as a paradigm of cancer genetics[J];癌症;2011年02期

2 宋乐乐;马琳艳;张旭东;蒋志文;刘浩;蒋琛琛;;衣霉素联合顺铂对人鼻咽癌细胞增殖和凋亡的影响[J];南方医科大学学报;2012年06期

本文编号：851236