蒽醌化合物GXHSWAQ-2介导鼻咽癌放射增敏的线粒体差异蛋白分析及CDH1蛋白功能研究

发布时间：2017-09-16 09:48

  本文关键词：蒽醌化合物GXHSWAQ-2介导鼻咽癌放射增敏的线粒体差异蛋白分析及CDH1蛋白功能研究

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【摘要】：目的：通过生物信息学方法分析葸醌化合物GXHSWAQ-2促进鼻咽癌细胞放射增敏的线粒体差异表达蛋白质的质谱结果,筛选出与放射增敏密切相关的关键蛋白靶点。并选取CDH1蛋白质作为研究对象,构建RNA干扰CDH1慢病毒表达体系,探讨沉默该蛋白质对鼻咽癌细胞生物学行为的影响,为寻找GXHSWAQ-2放射增敏的蛋白靶点提供依据。 方法：(1)根据差异蛋白筛选原则统计分析与放射增敏相关线粒体差异蛋白,并通过DAVID数据库对差异蛋白质的亚细胞定位、分子功能和参与的生物过程进行聚类分析。利用STRING数据库绘制差异蛋白互作网络图,结合NCBI、uniprot、KEGG等数据库分析筛选候选的关键蛋白质；(2)应用Western blot验证候选靶蛋白的表达水平；(3)利用基因重组技术,构建针对CDH1靶蛋白的四条shRNA干扰慢病毒表达载体,转鼻咽癌CNE-1细胞,经由荧光定量PCR和in-cell Western方法筛选出沉默效果最佳的干扰片段。通过流式细胞仪分选、建立稳定沉默CDH1表达的细胞亚系；(4)对沉默CDH1表达后鼻咽癌CNE-1细胞,分别采用MTT法绘制细胞的生长曲线；划痕法检测细胞迁移能力；流式细胞仪分析细胞生长周期。 结果：(1)照射组、GXHSWAQ-2组和GXHSWAQ-2联合照射组3组与空白对照组比较差异蛋白共有195种,其中上调68种,下调127种。这部分蛋白质主要定位于细胞器、核内和细胞骨架上,参与细胞内物质转运及代谢、RNA转录翻译和加工、细胞应激反应、细胞周期调节和氧化还原反应等生物过程。通过蛋白互作网络图分析确定RAC1CDH1HSP90、 CDC42、 COPS2等5个与放射增敏相关的候选靶蛋白；(2) Western blot方法证实RAC1与CDH1在各组细胞中的表达与质谱结果基本一致；(3)成功构建了慢病毒干扰CDH1表达载体,测序结果显示插入序列正确。转染鼻咽癌CNE-1细胞后,荧光显微镜观察结果表明慢病毒感染有效。in-cell Western和荧光定量PCR结果显示LV-CDH1-homo-1184片段的沉默CDH1效果最好(尸0.05)。经流式细胞仪分选感染LV-CDH1-homo-1184片段的细胞后,长期培养,荧光不消失,CDH1表达仍较空白组和阴性对照组低,获得稳定沉默CDHl表达的鼻咽癌CNE-1细胞株；(4)MTT法绘制出空白对照组、阴性对照组和LV-CDH1-homo-1184组细胞生长曲线,发现各组细胞增殖趋势一致。其中阴性对照组细胞生长速度最快,LV-CDH1-homo-1184组细胞生长速度最慢。划痕结果表明各组细胞的划痕随时间延长,逐渐愈合,其中LV-CDH1-homo-1184细胞迁移速率相对较慢；细胞周期分析结果表明,LV-CDH1-homo-1184组细胞处于G2M期比例相对较高。 结论：(1)通过生物信息学分析,RAC1、CDH1、CDC42、HSP90、 COPS2五个蛋白有可能成为葸醌化合物GXHSWAQ-2放射增敏作用的蛋白靶点。(2)沉默了CDH1的鼻咽癌细胞其生物学行为发生了一定的改变,CDH1有可能成为鼻咽癌放射治疗新的靶点。
【关键词】：鼻咽癌细胞 蒽醌化合物GXHSWAQ-2 放射增敏 线粒体蛋白 RNA干扰 CDH1
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-14
• 参考文献12-14
• 第一章 GXHSWAQ-2促进鼻咽癌细胞放射增敏的线粒体差异表达蛋白质生物信息学分析14-52
• 1 材料14-15
• 2 方法15-19
• 2.1 蛋白质表达的差异分析15-16
• 2.2 与增敏相关的差异蛋白表达模式分析16
• 2.3 差异蛋白并集分析16-17
• 2.4 差异蛋白质谱结果western blot验证17-19
• 3 结果19-43
• 3.1 蛋白表达的差异统计19-37
• 3.2 与增敏相关的差异蛋白表达模式统计37-38
• 3.3 差异蛋白的GO聚类分析38-39
• 3.4 节点蛋白分析结果39-43
• 3.5 蛋白免疫印迹验证差异蛋白相对表达量43
• 4 讨论43-49
• 参考文献49-52
• 第二章 RNA干扰CDH1慢病毒载体构建及干扰后鼻咽癌细胞生物学行为研究52-83
• 1 材料52-55
• 2 实验方法55-66
• 2.1 RNA干扰靶点设计及shRNA质粒载体的构建55-59
• 2.2 有效干扰靶序列的筛选59-65
• 2.3 干扰后鼻咽癌细胞生物学行为研究65-66
• 3 结果66-78
• 3.1 慢病毒载体测序结果66-67
• 3.2 荧光显微镜下观察各转染组荧光表达情况67-69
• 3.3 荧光定量PCR方法确定干扰片段沉默效果69-71
• 3.4 in-cell Western方法确定干扰片段沉默效果71-73
• 3.5 获得稳定沉默CDH1表达的鼻咽癌CNE-1细胞株73
• 3.6 干扰CDH1后鼻咽癌CNE-1细胞的生长曲线73-75
• 3.7 干扰后细胞迁移能力的变化75-76
• 3.8 流式细胞仪检测不同干预处理后细胞周期的变化76-78
• 4 讨论78-81
• 参考文献81-83
• 全文小结83-84
• 综述84-93
• 1. RNA干扰概述84
• 2. RNAi在药物研发中的应用84-88
• 3. 展望88-89
• 参考文献89-93
• 致谢93-94
• 攻读硕士研究生学位期间参与的课题及发表的论文94

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 翁婉雯;许玉杰;万建美;王宗站;丁文秀;刘敏;洪承皎;;紫杉醇放射增敏作用的分子机制[J];癌症;2009年08期

2 陈琳;徐酉华;温贤浩;杨山;于洁;戴碧涛;李欣;;RNA干扰survivin基因对K562细胞化疗敏感性的影响及机制[J];第三军医大学学报;2008年22期

3 钟琦;黄志刚;王琪;房居高;陈晓红;张伟;王鸿;洪锐;杨征;;MDR1基因RNA干扰逆转喉癌细胞多药耐药性的研究[J];中国耳鼻咽喉头颈外科;2010年05期

4 任维维;李征;米登海;杨克虎;田金徽;张质钢;;甘氨双唑钠对非小细胞肺癌放射治疗增敏作用的Meta分析[J];中国肺癌杂志;2012年06期

5 周庚寅;张晓芳;;肿瘤多药耐药机制及其逆转[J];临床与实验病理学杂志;2009年04期

6 刘瑾;吴锦昌;周俊东;;POLⅠ基因对人食管癌细胞放化疗敏感性的影响[J];南京医科大学学报(自然科学版);2013年01期

7 赵维勇;孙新臣;;放射治疗增敏的研究现状[J];临床肿瘤学杂志;2012年07期

8 唐军;傅大煦;;靶向小分子创新药物[J];现代生物医学进展;2010年20期

9 郭会灿;;RNA干扰技术的基础研究与应用[J];生物技术通报;2011年04期

10 仇波;林毅;王勇;陶钧;欧绍武;王运杰;;紫杉醇在TRAIL诱导脑胶质瘤干细胞凋亡中的增敏作用研究[J];现代肿瘤医学;2013年03期

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本文编号：862333