鼻咽癌抑瘤基因DLC1作用机制初步研究

发布时间：2017-09-16 12:40

  本文关键词：鼻咽癌抑瘤基因DLC1作用机制初步研究

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【摘要】：鼻咽癌是我国南方省份和东南亚地区一种高发的恶性肿瘤,有着特殊的种族和地理分布。病因学研究认为,鼻咽癌是由遗传因素、环境因素、EBV (Epstein-Barr virus)感染共同作用引发的。由于鼻咽癌发生时没有明显的病痛,鼻咽癌患者被确诊时往往已经是晚期阶段。目前为止,鼻咽癌的发病机理研究虽然取得了很大的进展,但是其真正的发病机制仍尚未完全阐明,这就使得鼻咽癌的早期诊断及临床治疗非常困难。因此,找到与鼻咽癌早期诊断相关的信号分子并应用于临床有着重要的意义。 肝癌缺失基因-1(Deleted in liver cancer1, DLC1)是Yuan等在1998年首次从肝脏组织中通过代表性差异分析(representational difference analysis, RDA)方法克隆获得。本课题组的前期研究发现DLC1在鼻咽癌中出现较高比例的表达下调或缺失,而这种改变与DLC1启动子区域DNA异常甲基化和微卫星位点的杂合性丢失(LOH)有关。为进一步研究DLC1在鼻咽癌中的作用机制,本课题组选择了DLC1基因表达缺失的高成瘤、高转移鼻咽癌细胞系5-8F,利用稳定转染技术过表达DLC1,建立稳定表达DLC1基因的细胞系5-8F-DLC1及对照组细胞系5-8F-vector。研究发现,过表达DLC1的5-8F细胞,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞骨架的形成和分布发生改变,细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力均呈现不同程度的下降。 本研究拟在前期工作基础之上,进一步研究DLC1在鼻咽癌中的作用机制。 目的： 应用基因表达谱芯片技术,筛选出过表达DLC1的鼻咽癌细胞中差异表达的基因,分析其中差异表达的基因的内在联系,研究DLC1在鼻咽癌中的作用机制。 方法： 1利用基因表达谱芯片技术对5-8F-vector和5-8F-DLC1两株细胞进行分析,然后用生物分子功能注释系统MAS3.0中的KEGG以及GO软件对芯片结果中差异表达的基因进行生物信息学分析,预测DLC1在鼻咽癌中可能参与调控的信号通路及关键分子。 2利用RT-PCR和Real-time PCR技术对芯片结果中部分上调和下调的基因进行验证。 3应用流式细胞术对5-8F-vector和5-8F-DLC1两株细胞进行细胞凋亡检测。 4利用线粒体膜电位检测试剂盒对5-8F-vector和5-8F-DLC1两株细胞进行线粒体膜电位检测。 5运用western blot技术对线粒体凋亡相关分子进行检测,初步探讨DLC1促进鼻咽癌细胞凋亡的作用机制。 6运用western blot技术对转移相关分子进行检测,初步探讨其抑制鼻咽癌转移的作用机制。 结果： 1基因表达谱分析发现,与5-8F-vector细胞相比,5-8F-DLC1中454个基因表达上调,如IGFBP7、TNS1、TP53、TP63等386个基因表达下调,如EGFR、KRAS、TGFβ32等。GO分析发现,DLC1引起21种生物学功能发生了改变；KEGG分析发现,DLC1可能参与调控30条不同的信号通路。 2RT-PCR和Real-time PCR技术对芯片结果中部分上调基因(WNT5A、TNS1、FHL1、S100A2、RECK、DUSP、CASP9、IGFBP7)以及下调的基因(EGFR、CDCP1、KRAS、TGFβ2、Akt3、MMP7、 MUC4、BCL10、PTK6)进行验证,结果与芯片数据一致。 3流式细胞仪结果显示,5-8F-DLC1细胞凋亡率明显高于5-8F-vector细胞。 4线粒体膜电位检测发现,5-8F-DLC1细胞膜电位低于5-8F-vector细胞。 5Western blot结果显示,与5-8F-vector细胞相比较,5-8F-DLC1细胞中与凋亡相关的分子(如caspase9、caspase3、细胞色素c、Bcl-2、 Bax等)以及转移相关的分子(如MMP2、MMP7、MMP9、Snail、 E-cadherin、TRAF5、NF-κB等)均发生了明显的改变。 结论 1在鼻咽癌中过表达抑瘤基因DLC1,会影响鼻咽癌细胞中的部分瘤基因、抑瘤基因以及其它一些重要的信号分子的表达。生物信息学分析表明,DLC1参与调控鼻咽癌细胞中一些重要的信号通路。 2DLC1能通过线粒体凋亡通路促进细胞凋亡。 3DLC1可能通过PI3K/Akt/NF-KB/Snail或TRAF5/NF-KB/Snail信号通路抑制鼻咽癌细胞的侵袭和转移。
【关键词】：鼻咽癌 DLC-1基因 基因芯片 细胞凋亡 侵袭与转移
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要5-9
• Abstract9-15
• 缩略语简表15-16
• 前言16-20
• 技术路线20-22
• 第一章 鼻咽癌5-8F细胞中过表达DLC1后的基因表达谱分析及验证22-35
• 第一节 材料与方法22-27
• 1. 材料22-24
• 2. 方法24-27
• 第二节 实验结果27-33
• 1. RNA质量检测27
• 2. 过表达DLC1的5-8F细胞中DLC1基因检测27-28
• 3. 芯片扫描结果28
• 4. 基因表达谱芯片结果分析28
• 5. 利用GO和KEGG软件在线分析芯片结果28-32
• 6. RT-PCR和Real-time PCR验证芯片结果32-33
• 第三节 分析与讨论33-35
• 第二章 DLC1通过线粒体凋亡途径促进鼻咽癌细胞凋亡35-46
• 第一节 材料与方法35-40
• 1. 材料35-36
• 2 方法36-40
• 第二节 实验结果40-43
• 1 Western blot检测5-8F-vector和5-8F-DLC1细胞中DLC-1蛋白的表达40
• 2 流式细胞仪检测细胞凋亡,过表达DLC1后鼻咽癌细胞凋亡率上升40-41
• 3 线粒体膜电位检测41
• 4 过表达DLC1能促进线粒体凋亡关键分子caspase-9和Cytochrome c表达41-42
• 5 过表达DLC1能促进Apaf-1和caspase-3的表达42
• 6 过表达DLC1,促凋亡分子Bax表达水平上升,抑制凋亡分子Bcl-2和Bcl-xL表达受到抑制42-43
• 第三节 分析与讨论43-46
• 第三章 DLC1通过PI3K/Akt和NF-κB/Snail或是TRAF5/NF-κB/Snail信号通路抑制鼻咽癌5-8F细胞侵袭和转移46-52
• 第一节 材料和方法46-47
• 1、材料46
• 2、方法46-47
• 第二节 实验结果47-49
• 1 过表达DLC1后TNFR相关因子TRAFs家族成员TRAF5在鼻咽癌5-8F细胞中的表达下降47
• 2 过表达DLC1后,磷酸化Akt1/2表达受到抑制,PI3K表达下调47
• 3 过表达DLC1后,NF-κB家族成员p65以及磷酸化p65、p105表达受到抑制47
• 4 过表达DLC1后明显抑制MMP2/7/9在鼻咽癌5-8F细胞中的表达47-48
• 5 过表达DLC1后,细胞黏附分子E-cadherin表达明显上升,而转录因子Snail表达受到抑制48-49
• 第三节 分析与讨论49-52
• 结论52-53
• 参考文献53-61
• 综述 DLC-1与肿瘤61-68
• 参考文献64-68
• 致谢68-69
• 攻读学位期间主要研究成果目录69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 ;Genetic and Epigenetic Alterations of DLC-1,a Candidate Tumor Suppressor Gene,in Nasopharyngeal Carcinoma[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2006年05期

2 王怀宇;张梅;贺鹏程;杨冰静;邵玲燕;邵文斌;;人骨髓瘤细胞株基因表达谱经沙利度胺诱导的变化[J];中国实验血液学杂志;2010年02期

3 宋丽杰,叶胜龙,王凯峰,翁永强,梁春敏,孙瑞霞,赵燕,刘银坤,汤钊猷;DLC-1基因表达与肝细胞癌复发转移的关系[J];中华肝脏病杂志;2005年06期

4 Ferenc Sipos;Orsolya Galamb;;Epithelial-to-mesenchymal and mesenchymal-to-epithelial transitions in the colon[J];World Journal of Gastroenterology;2012年07期

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本文编号：863116