proBDNF影响新生大鼠SGNs存活及神经突生长的实验研究

发布时间：2017-09-16 19:24

  本文关键词：proBDNF影响新生大鼠SGNs存活及神经突生长的实验研究

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【摘要】：目的：建立稳定可靠的无血清SGNs体外培养体系,使用免疫荧光染色对SGNs进行鉴定,观察培养的SGNs存活数目及神经突生长规律。比较不同浓度proBDNF对培养SGNs存活及神经突生长的影响,并与BDNF组比较。观察SGNs中p75NTR的表达特点,验证JNK信号通路在proBDNF影响SGNs存活中的作用。方法：取新生3—5天SD大鼠处死并解剖出含有螺旋神经节的蜗轴,将蜗轴剪成小块后直接接种于层粘连蛋白及右旋多聚赖氨酸包被好的8孔腔式载玻片中,37℃恒温培养箱中培养24h获得贴壁牢固的SG组织块：或将蜗轴于胰蛋白酶中消化30分钟,胎牛血清终止消化后吹打成细胞悬液。漂洗、重悬后将细胞悬液接种于包被的8孔腔式载玻片中,37℃恒温培养箱中培养4h获得贴壁牢固的原代SGNs。选择消化法培养SGNs,随机分为对照组、BDNF组(BDNF, 10ng/ml)、C10组(proBDNF,10ng/ml)、C50组(proBDNF,50ng/ml)、C100组(proBDNF, 100ng/ml),分别在培养液中加入各浓度的营养因子。继续培养48h后所有SGNs行TUJ1、p75NTR及DAPI免疫荧光染色,荧光显微镜下观察SGNs的存活数目和神经突再生情况,并进行相关统计分析。另培养一批SGNs,培养4h后随机分为三组,分别添加50ng/ml proBDNF、50ng/ml proBDNF+20μM SP600125、20μMSP600125,其余步骤同上进行。结果：组织块法培养的螺旋神经节组织贴壁牢固,大量神经突从组织块向外伸展,周围区域零散分布着存活良好的SGNs。消化法培养的单离SGNs生长状态较均一,培养52h后可见无突起、单极突起、双极突起、多极突起等形态类型的SGNs,其中单极突起SGNs数目最多,为48.2±4.2/孔,无突起和双极突起SGNs数目分别为20.0±4.9/孔、7.5±2.2/孔,多极突起SGNs数目最少,为4.2±±1.9/孔。添加不同浓度proBDNF作用48h后,对照组的SGNs存活数目为79.8±5.3/孔,BDNF组存活数目为82.3+6.0/孔,C10组、C50组、C100组分别为69.7+6.3/孔、54.3+4.6/孔、22.7±4.1/孔。C50组和C100组的SGNs存活数目低于对照组(P0.001),且C10组、C50组和C100组的SGNs存活数目均低于BDNF组(P0.001)。将SGNs的形态分为无突起和有突起两类,统计发现C10组、C50组、C100组的无突起SGNs比例均高于对照组(P0.001)。另外在添加20μM的SP600125后,C50组的SGNs存活数目提升至91.5±8.2/孔,高于没有使用SP600125的C50组(P0.001)。结论：组织块培养法和无血清消化培养法都能成功培养出SGNs。使用消化培养法更容易获得生长状态均一的单离SGNs,消化培养法比组织块培养法更适合用于体外因素影响SGNs存活与生长的研究。proBDNF可以促进体外培养SGNs的凋亡,并抑制神经突的再生。proBDNF会导致SGNs中p75NTR的表达水平升高,阻断JNK信号能减小proBDNF对SGNs的促凋亡作用。p75NTR-JNK信号通路是proBDNF对SGNs的作用机制之一。
【关键词】：proBDNF 螺旋神经节神经元 p75受体 JNK
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764
【目录】：

• 缩略词表4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-11
• 材料与方法11-17
• 1. 实验材料11-12
• 1.1 实验动物11
• 1.2 试剂及耗材11-12
• 1.3 主要仪器12
• 2. 实验方法12-17
• 2.1 SGNs的组织块培养法12-14
• 2.2 SGNs的消化培养法14-15
• 2.3 实验分组处理15-16
• 2.4 SGNs的免疫荧光染色鉴定16
• 2.5 SGNs存活数目及形态的统计16-17
• 结果17-35
• 1. 使用组织块法培养的SGNs17-20
• 2. 使用消化培养法培养的SGNs20-27
• 3. proBDNF对SGNs存活的影响27-31
• 4. proBDNF对SGNs神经突再生的影响31-32
• 5. SGNs中p75NTR的表达分布特点32-33
• 6. 抑制JNK通路对SGNs存活率的影响33-35
• 讨论35-40
• 结论40-41
• 参考文献41-45
• 综述45-55
• 参考文献50-55
• 附录55-56
• 致谢56-57

【参考文献】

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1 刘宇;邓宇斌;周丽华;;p75NTR介导神经细胞凋亡研究进展[J];生命科学;2007年01期

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本文编号：864984