PCR-RFLP法快速鉴定镰刀菌感染的真菌性角膜炎

发布时间：2017-09-22 09:28

  本文关键词：PCR-RFLP法快速鉴定镰刀菌感染的真菌性角膜炎

  更多相关文章： 镰刀菌属 角膜炎 聚合酶链反应 限制性内切酶片段长度多态性

【摘要】：目的：从临床疑似真菌感染性角膜炎患者的角膜刮片中分离、提取DNA,建立一种临床常见真菌的基因聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测方法，进行实验研究以及临床应用。 方法：根据医学真菌的线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI）基因片段合成了镰刀菌、青霉菌、拟青霉菌、白僵菌、红酵母等5种临床常见真菌的通用引物。取临床标本，，分离真菌菌株，采用应用改良的GenTLETMDNA试剂盒提取方法方法提取DNA，用以上引物以及真菌通用引物ITS以及COI扩增基因组的ITS和COI的基因片段并测序，在GenBank核酸序列数据库进行同源序列搜索及分析，用限制性内切酶SspI及VspI酶切目的片段，行2.0%TAE琼脂糖凝胶电泳照相观察，分析比较酶切图谱，初步检测其特异性。 结果：各菌株基因组DNA经ITS1、ITS4扩增后得到的片段长度约为550bp，产物分别回收进行核苷酸序列测定，并与GenBank中相应序列进行比对，以鉴定菌种。各菌株基因组DNA经COI-all1，COI－all2引物扩增后得到的目的片段长度在450bp左右。测序后进行酶切分析，用限制性内切酶SspI及VspI酶切目的片段，根据酶切图谱可以进一步将镰刀菌鉴定到种。 结论：本研究中6种菌15株均可以用COI-all1，COI－all2引物扩增，得到450bp左右的片段。使用COI扩增的茄病镰刀菌，尖孢镰刀菌，串珠镰刀菌的PCR产物经VspI和SspI两种限制性内切酶酶切条带具有种内多态性，提示可以用于鉴别镰刀菌属的种间鉴定。限制性片段长度多态性分析方法可用于快速、简便地将镰刀菌鉴定到种，有很好的应用前景。
【关键词】：镰刀菌属 角膜炎 聚合酶链反应 限制性内切酶片段长度多态性
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R772.21
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 前言10-14
• 第二章 材料与方法14-21
• （一）实验菌株14
• （二）主要试剂及配制：14-17
• 1. 试剂名称14-15
• 2. 试剂配制15
• 3. 主要仪器设备15-16
• 4. 菌种通用引物的选择16
• 5. 菌种特异性引物设计16-17
• （三）实验方法17-21
• 1. 菌株的培养17
• 2. 真菌 DNA 提取17-18
• 3. ITS 引物 PCR 反应条件18
• 4. COI 引物的 PCR 反应条件优化18-19
• 5. 琼脂糖凝胶电泳19
• 6. PCR 反应产物纯化19
• 7. 限制性片段长度多态性(PCR－RFLP)19-21
• 第三章 结果21-26
• （一）基因组 DNA 的提取及浓度的检测21-22
• （二）ITS 引物 PCR 反应及测序结果22
• （三）COI 引物的 PCR 反应条件优化结果22-23
• （四）各菌株 COI 引物扩增结果23
• （五）RFLP 结果23-26
• 第四章 讨论26-30
• 第五章 结论30-31
• 参考文献31-34
• 综述34-50
• 参考文献44-50
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果50-51
• 致谢51-52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王文华;李树明;任玉新;李春龙;;氟康唑治疗真菌性角膜炎的临床探讨[J];国际眼科杂志;2006年01期

2 Shawarinin Jusoh;Effat Omar;Manickam Ravichandran;Mohtar Ibrahim;;镰孢菌属镰刀菌致与接触镜有关的真菌性角膜炎1例(英文)[J];国际眼科杂志;2008年04期

3 李鹏;李良毛;潘世锦;;真菌性角膜炎诊断及治疗的新进展[J];国际眼科杂志;2008年10期

4 陈洪,朱立煌,陈美玲,李冬梅;致病性念珠菌DNA的AFLP指纹图谱[J];科学通报;1996年10期

5 陈若雷,宋道军,余增亮;RAPD分子标记及其在作物遗传育种中的应用[J];生物学杂志;2000年04期

6 安娜;王亚妮;刘先宁;朱娟莉;朱秀萍;吴洁;;真菌性角膜炎致病菌种属的PCR鉴定[J];眼科新进展;2010年11期

7 薛燕,常洪,常国斌;PCR-SSCP技术在动物育种中的研究进展[J];畜牧兽医杂志;2005年03期

8 卢嘉彪,陈家祺,王丽娅;广州地区真菌性角膜病的病原体及其发病情况的变迁[J];眼科研究;1998年04期

9 付怀平,王印其,王俊英;真菌性角膜溃疡21例病理诊断分析[J];眼科研究;1999年02期

10 孙旭光,张岩,李然,王智群,罗时运,金秀英,张文华;Etiological analysis on ocular fungal infection in the period of 1989-2000[J];Chinese Medical Journal;2004年04期

本文编号：900051