白内障致病基因HSF4与SNF8相互作用的鉴定

发布时间：2017-09-27 10:12

  本文关键词：白内障致病基因HSF4与SNF8相互作用的鉴定

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【摘要】：先天性白内障是儿童致盲的主要原因之一，发病率大约为0.3-1.5/1000，近一半的先天性白内障是与遗传相关的，已经确定的可导致先天性白内障的有26个致病基因，以及大约40个可能的基因位点。在调控晶状体早起发育中，热休克转录因子4（HSF4）作为转录因子起到关键作用，位于DNA结合结构域的错义突变会导致先天性白内障。HSF4有HSF4a和HSF4b两种亚型。HSF4b缺失可下调鼠晶状体中热休克蛋白的表达，同时还会上调FGF家族成员的表达。然而，HSF4转录活性的具体分子机制尚不清楚，研究与HSF4相互作用的蛋白质对于建立HSF4相关蛋白的相互作用网络，以及这一转录因子是如何在晶状体发育中发挥作用的具有重要意义。 本实验室前期工作中，通过酵母双杂交的方法发现可能与HSF4存在相互作用的蛋白质——SNF8。本文主要利用GST pull-down技术和免疫共沉淀技术这两种方法对酵母双杂交结果——HSF4与SNF8之间存在相互作用进行进一步验证。 本实验中首先通过免疫组化发现SNF8在小鼠晶状体中表达，蛋白印迹分析发现其在人的晶状体上皮（HLE）细胞中表达。从HLE细胞cDNA文库中克隆得到SNF8基因全长，并将其编码序列插入真核表达载体p3×FLAG-CMV-7.1中，测序后转染HLE细胞进行表达；同时将重组的原核表达载体pGEX-6P-1-hsf4b转化到BL21大肠杆菌中，通过IPTG诱导，经过谷胱甘肽TM4B琼脂糖珠纯化后与含有上述外源表达SNF8蛋白质的细胞裂解液进行孵育，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现HSF4b与SNF8之间存在相互作用。 基于GST pull-down的结果，我们用免疫共沉淀的方法对HSF4b与SNF8之间的互作关系进行进一步验证分析。将真核表达质粒p3×FLAG-CMV-7.1-SNF8和pEGFP-Hsf4b-wt共同转入HLE细胞，48小时后裂解细胞，向裂解液中加入抗标签蛋白的抗体进行孵育，再与Protein A/G琼脂糖珠子孵育一段时间，洗涤洗脱后经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表明HSF4b与SNF8之间确实存在相互作用。为揭示HSF4关键的功能元件，我们进一步通过系列缺失的方法，，验证蛋白质HSF4b内部不同的结构域在这一相互作用过程中的意义，发现HSF4b的DBD结构域和HR A/B结构域对于HSF4b与SNF8之间的相互作用是至关重要的，而DHR结构域则对二者相互作用影响不大。
【关键词】：先天性白内障 HSF4 SNF8 免疫组化 免疫共沉淀
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R776.1
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 1 前言9-18
• 1.1 先天性白内障研究进展9-12
• 1.2 HSF4 基因与先天性白内障12-14
• 1.3 SNF8 基因概述14-15
• 1.4 实验方法概述15-18
• 2 材料与方法18-37
• 2.1 实验材料18-25
• 2.2 实验方法及步骤25-37
• 3 结果与讨论37-44
• 3.1 实验结果37-41
• 3.2 讨论41-44
• 4 总结和展望44-46
• 致谢46-48
• 参考文献48-53

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈谋通;刘建军;;蛋白质相互作用的研究方法[J];生物技术通报;2009年01期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 张军;热休克转录因子4基因突变致先天性白内障分子机理研究[D];河南大学;2010年

本文编号：929083