31种广东植物体外抗NPC活性的筛选及夹竹桃抗NPC作用和机制的初步研究

发布时间：2017-09-29 02:20

  本文关键词：31种广东植物体外抗NPC活性的筛选及夹竹桃抗NPC作用和机制的初步研究

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【摘要】：研究背景和目的： 鼻咽癌(NPC)是广东省高发的头颈部恶性肿瘤之一,具有“广东癌”之称,易发生早期侵袭、转移,目前鼻咽癌的治疗以放疗和化疗为主[3-6],5年生存率维持在45-50%左右[6-10],且放化疗后毒副作用大,还存在远期效果不明显和耐药性等问题,因此,寻找有效的治疗药物对提高患者的生存期具有重要意义。本研究通过MTT法从31种广东省植物提取物中初步检测其抗鼻咽癌活性,通过分析比较他们的抗肿瘤活性大小后从这31种植物提取物中筛选出三种具有较强抗肿瘤活性植物提取物进行鼻咽癌凋亡检测,以进一步比较这三种提取物的抗鼻咽癌效果(这三种植物提取物分别是：夹竹桃、牛耳风、牡荆)。通过分析比较从这三种植物提取物中筛选出一种最佳的抗鼻咽癌药物--夹竹桃提取物,并对其抗鼻咽癌作用及机制进行进一步的研究。本研究在MTT法初步筛选具有抗鼻咽癌活性药物时以肺癌A549细胞作为阳性对照。 方法： ①采用MTT法检测31种来自于广东的植物提取物对鼻咽癌增殖的影响,并以肺癌A549细胞作为阳性对照。分析比较各植物提取物的抗鼻咽癌活性大小后选出三种具有较强抗肿瘤活性的植物提取物进行鼻咽癌凋亡检测。初步筛选出的三种植物提取物分别是：夹竹桃、牛耳风、牡荆。 ②采用流式细胞仪检测夹竹桃、牛耳风、牡荆三种植物提取物对鼻咽癌细胞凋亡的影响(PI和Annexin-V双标法)。通过分析比较从这三种植物提取物中筛选出一种最佳的抗鼻咽癌药物,并对其抗鼻咽癌作用及机制进行进一步的研究。经二重筛查后筛选出的最佳抗鼻咽癌药物是：夹竹桃提取物。 ③采用平板克隆形成实验检测夹竹桃提取物对鼻咽癌及肺癌细胞集落形成能力(增殖能力)的影响。 ④侧群细胞可作为肿瘤干细胞的新型代表,采用流式细胞仪检测夹竹桃桃提取物对鼻咽癌侧群(SP)细胞的影响。 ⑤肿瘤球含有肿瘤干细胞的多种特性,通过肿瘤球培养法(肿瘤球形成实验)观察夹竹桃提取物对肿瘤干细胞的影响,检测夹竹桃桃提取物对鼻咽癌原代肿瘤球及第二代肿瘤球的效应。 ⑥采用蛋白质免疫印迹技术(WESTERN BLOT)检测夹竹桃桃提取物抑制鼻咽癌的分子机制。 ⑦统计方法： 本实验数据均采用graph prism5软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示。三个及三个以上药物浓度处理组的平板克隆形成数量、凋亡比例、侧群比例、肿瘤球直径、肿瘤球数量等数据均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组差异。。P0.05被认为有统计学差异。 结果： 一、MTT法初步比较31种植物提取物抗鼻咽癌活性大小。 MTT法初步检测构树、水茄、鹅掌柴、猪屎豆、使君子、毛排钱树、山芝麻、木荷、对叶蓉、南板兰、马兰、鹊梅藤、龙须藤、醉鱼草、石岩枫、五月艾、八角枫、峨眉唐松草、潺槁树、土荆芥、山大颜、夹竹桃、牛耳风、牡荆、金腰箭、含羞草、小叶榕、黄花捻、杨梅、龙船花、广防风等31种植物提取物的抗鼻咽癌活性。通过分析比较这31种植物提取物抗鼻咽癌活性大小后从中选出三种在小剂量药物浓度下能显著抑制鼻咽癌增殖的植物提取物,这三种植物提取物分别是：夹竹桃、牛耳风、牡荆。 二、比较牛耳风、牡荆、夹竹桃三种植物提取物抑制鼻咽癌CNE2细胞活性大小(以肺癌A549细胞作为阳性对照)。 1、 MTT法比较：在通过MTT法从31种植物提取物中初步筛选出夹竹桃、牛耳风、牡荆三种具有较强抗鼻咽癌活性后,进一步缩小药物检测浓度范围,再次通过MTT法检测夹竹桃、牛耳风、牡荆三种的抗鼻咽癌活性,以进一步比较其抗鼻咽癌活性大小。结果显示：牛耳风提取物可抑制鼻咽癌CNE2(P=0.0357)和肺癌A549(P=0.0026)细胞生长,且具有剂量依赖性。经计算,牛耳风提取物对CNE2和A549细胞的IC50分别为22.70931μg/ml和78.38118μg/ml牡荆提取物可抑制鼻咽癌CNE2(P0.0001)和肺癌A549(P0.0001)细胞生长,且具有剂量依赖性。经计算,牡荆提取物对CNE2和A549细胞的IC50分别为130.6466μg/ml和184.6874μg/ml。夹竹桃提取物可显著抑制鼻咽癌CNE2(P0.01)和肺癌A549(P0.01)细胞生长,且具有剂量依赖性。经计算,夹竹桃提取物对CNE2和A549细胞的IC50分别为3.082226μg/ml和5.04μg/ml。通过分析比较这三种植物提取物抗鼻咽癌的IC50值大小后发现夹竹桃IC50值最小。 2、流式细胞凋亡检测法比较：采用流式细胞仪检测夹竹桃、牛耳风、牡荆三种植物提取物对鼻咽癌CNE2细胞凋亡的影响(PI和Annexin-V双标法)。通过分析比较从这三种植物提取物中筛选出一种最佳的抗鼻咽癌药物,并对其抗鼻咽癌作用及机制进行进一步的研究。通过分析比较这三种植物提取物诱导鼻咽癌凋亡率大小后发现夹竹桃诱导鼻咽癌效果最显著。经MTT筛选及凋亡检测双重筛查后筛选出的最佳抗鼻咽癌药物是：夹竹桃提取物。 (A)、牛耳风提取物显著诱导鼻咽癌CNE2细胞(F=30.85,P=0.0007)凋亡。 取浓度分别为0μg/ml、12.5μg/ml、25μg/nd的牛耳风提取物作用于CNE2细胞24小时后,凋亡比例分别为：3.37±1.650,22.47±5.479、36.73±7.001,凋亡细胞比例随药物浓度的增加而显著增加。经单因素方差分析,各组凋亡率之间比较,差异具有统计学意义。 (B)、牡荆提取物可诱导鼻咽癌CNE2细胞(F=27.95,P=0.0009)凋亡。 取浓度分别为Opg/ml、75μg/ml、150μg/ml的牡荆提取物作用于CNE2细胞48小时后,凋亡比例分别为：3.37±1.650,12.37±±2.815、27.17±5.988,凋亡细胞比例随药物浓度的增加而显著增加。经单因素方差分析,各组凋亡率之间比较,差异具有统计学意义。 (C)、夹竹桃提取物显著诱导鼻咽癌CNE2细胞(F=37.06,P=0.0004)凋亡。取浓度分别为0μg/ml、1.5μg/ml、3μg/ml的夹竹桃提取物作用于CNE2细胞18小时后,凋亡比例分别为：3.37±1.650,27.07±4.924、37.43±6.862,凋亡细胞比例随药物浓度的增加而显著增加。经单因素方差分析,各组凋亡率之间比较,差异具有统计学意义。 三、夹竹桃提取物能显著抑制鼻咽癌CNE2细胞(F=153.6,P0.0001)克隆形成。采用平板克隆形成实验检测夹竹桃提取物抑制鼻咽癌细胞克隆形成的情况,分别取0μg/ml、1.5μg/ml、3μg/ml夹竹桃提取物作用于鼻咽癌CNE2细胞2周后,克隆形成数量分别为：255.33±28.746、30.67±15.822、10.33±2.517。细胞克隆形成数量随着药物浓度的增加而减少,呈剂量依赖关系。经单因素方差分析,各浓度组别之间的差异具有统计学意义。 四、夹竹桃提取物抑制鼻咽癌干细胞生长。 1、夹竹桃提取物降低鼻咽癌CNE2侧群细胞比例(F=27.40,P=0.001)。取浓度分别为0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml的夹竹桃提取物作用于CNE2细胞48小时后,侧群细胞比例分别为：3.27±0.764、1.23±0.493、0.13±0.058。经单因素方差分析,各浓度组别之间的差异具有统计学意义。 2、夹竹桃提取物能抑制鼻咽癌CNE2肿瘤球直径大小(F=9.105,P=0.0023)。肿瘤球含有肿瘤干细胞的多种特性,通过肿瘤球培养法观察夹竹桃提取物对肿瘤干细胞的影响。细胞培养在无血清肿瘤球培养基中,取浓度分别为0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml的夹竹桃提取物处理CNE2细胞1-2周后检测肿瘤球直径,直径分别为：501.00±160.558μm、300.33±146.374μm、170.33±81.206μm、96.33±32.532μm、44.00±19.519μm。经完全随机设计的单因素方差分析,差异具有统计学意义。可以认为夹竹桃提取物能抑制鼻咽癌肿瘤球直径大小,药物浓度越大,肿瘤球直径越小。 3、夹竹桃提取物抑制原代鼻咽癌CNE2肿瘤球成球数量(F=36.57,P0.0001)。取浓度分别为0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/mh、3μg/ml的夹竹桃提取物处理CNE2细胞1-2周后,肿瘤球形成数量(个)分别为：546.33±114.269、345.67±68.017、151.33±39.829、66.67±17.039、17.67±7.638。经完全随机设计的单因素方差分析,差异具有统计学意义。 4、夹竹桃提取物抑制第二代鼻咽癌CNE2肿瘤球成球数量(F=13.88,P=0.0007)。第2代肿瘤球培养中,将经夹竹桃提取物处理后的原代肿瘤球再次消化,为单细胞悬液,重新进行肿瘤球培养,共7天,不加入任何药物处理。各组细胞再次形成肿瘤球的能力不同,各组第二代肿瘤球形成数量(个)分别为：273.00±98.686、172.33±39.004、95.67±28.537、33.67±6.658、16.33±4.163。经完全随机化设计的单因素方差分析,差异具有统计学意义。 五、夹竹桃提取物抑制鼻咽癌细胞生长的分子机制取浓度为3μg/ml的夹竹桃提取物处理鼻咽癌CNE2细胞3天后westernblot检测PI3K/Akt信号通路及线粒体途径凋亡信号通路相关因子的表达水平。实验结果显示,与空白对照组相比,夹竹桃提取物处理组的PI3K和Akt磷酸化水平表达量降低,而总的PI3K和Akt蛋白表达量无明显变化,这表明夹竹桃提取物抑制鼻咽癌细胞生长的作用可能是通过P13K/Akt信号通路来实现的。另外,实验结果还显示,与空白对照组相比,夹竹桃提取物处理组的促凋亡因子Bad的表达水平明显上调,抑凋亡因子Bcl-2表达水平显著下调,而抑凋亡因子Bcl-XL的表达量未见明显变化,同时,具有活性的cleaved caspase-3表达水平明显上调,这表明,在夹竹桃提取物诱导鼻咽癌细胞发生凋亡的事件中,线粒体途径参与其中。综上所述,夹竹桃提取物抑制鼻咽癌细胞生长的分子机制可能是通过PI3K/Akt信号通路[21-35]来实现的,通过抑制PI3K和Akt磷酸化,进而上调促凋亡因子Bad的表达,下调抑凋亡因子Bcl-2的表达,并通过线粒体凋亡途径(内源性凋亡途径)[36-46]活化caspase-3,从而抑制鼻咽癌细胞增殖,促进细胞凋亡。 六、夹竹桃提取物抑制鼻咽癌干细胞生长的分子机制β-catenin、c-myc、nanog及oct4是维持肿瘤干细胞生长和维持干细胞特性的重要因子,也是重要的肿瘤干细胞标志物。本研究取浓度为3μg/ml的夹竹桃提取物处理鼻咽癌CNE2细胞3天后western blot检测干细胞相关因子的表达水平。实验结果显示,与空白对照组相比,夹竹桃提取物处理组的β-catenin磷酸化水平表达量降低,而总的β-catenin蛋白表达量无明显变化,同时,c-myc表达也水平明显降低,而nanog及oct4表达水平未见明显变化,这表明夹竹桃提取物抑制鼻咽癌干细胞生长的作用可能是通过抑制β-catenin磷酸化以及抑制c-myc表达来实现的。 结论：①夹竹桃、牛耳风、牡荆三种植物提取物对鼻咽癌细胞生长具有较强抑制效应,其中夹竹桃的抑制效应最强。②夹竹桃提取物能抑制鼻咽癌细胞生长,其分子机制可能是通过PI3K/Akt信号通路来实现的。③夹竹桃提取物可通过抑制PI3K和Akt磷酸化,进而上调促凋亡因子Bad的表达,下调抑凋亡因子Bcl-2的表达,并通过线粒体凋亡途径(内源性凋亡途径)活化caspase-3,从而抑制鼻咽癌细胞增殖,促进细胞凋亡。④夹竹桃提取物能抑制鼻咽癌肿瘤干细胞的自我更新,其分子机制可能是通过抑制β-catenin磷酸化以及抑制c-myc表达来实现的。
【关键词】：鼻咽癌 肿瘤干细胞 夹竹桃
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-14
• 前言14-23
• 第一章 夹竹桃等31种广东植物对鼻咽癌生长的影响23-52
• 材料与方法23-30
• 结果30-45
• 讨论45-51
• 结论51-52
• 第二章 夹竹桃提取物对鼻咽癌生长的影响及其作用的分子机制52-88
• 材料与方法52-69
• 结果69-81
• 讨论81-87
• 结论87-88
• 全文小结88-90
• References90-106
• 中英文缩略词表106-107
• 致谢107-108

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈培;张钦宪;;PTEN-PI3K/AKT细胞信号转导通路与肿瘤[J];癌变·畸变·突变;2010年06期

2 章雄文,黄自强,李常春;黄花夹竹桃甙抗瘤作用机理的实验研究[J];癌症;1996年06期

3 曾凡星;朱晗;赵华;;PI3K阻断剂对大鼠运动骨骼肌Akt/mTOR信号的影响[J];北京体育大学学报;2010年11期

4 邓如明;孙春明;冯鸣;王君祥;周幽心;;PI3K、AKT、PTEN在脑胶质瘤中的表达及其临床意义[J];中国神经肿瘤杂志;2010年02期

5 张国千;;鼻咽癌放射治疗后放射性脑损伤的诊断及防治[J];当代医学;2009年18期

6 邓益平;毛凯;雷松柏;;鼻咽癌的CT诊断(附47例分析)[J];当代医学;2011年09期

7 张浩;房殿春;罗元辉;兰春慧;;线粒体途径在幽门螺杆菌诱导胃癌细胞凋亡中的作用[J];第三军医大学学报;2009年05期

8 吴建璋;肖义军;陈炳华;曾红;;夹竹桃多糖抗小鼠S_(180)肉瘤的实验研究[J];福建师范大学学报(自然科学版);2009年04期

9 瞿舒裴;左秋芳;李静;;积雪草苷霜治疗鼻咽癌放射性皮炎的效果观察[J];护士进修杂志;2010年04期

10 阮培刚;;护理干预在减轻鼻咽癌患者放疗中口腔黏膜炎的作用[J];护士进修杂志;2012年04期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 龚道军;CD97-siRNA转染对胃癌细胞株MKN45生物学特性的影响及其分子机制的初步研究[D];浙江大学;2009年

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本文编号：939429