二硫氨基甲酸肽吡咯烷抑制大鼠角膜新生血管形成的实验研究

发布时间：2017-10-07 16:30

  本文关键词：二硫氨基甲酸肽吡咯烷抑制大鼠角膜新生血管形成的实验研究

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【摘要】：研究背景 角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)是多种眼表疾病如感染性角膜炎、眼化学伤、热烧伤、非感染性角膜变性的重要特征之一,也是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素,是导致角膜盲的主要原因之一,角膜新生血管的防治对于治疗众多角膜疾病和预防角膜盲具有重大意义。 一直以来,众多研究人员致力于角膜新生血管发病机制的实验研究,试图从发病机制上预防或治疗角膜新生血管,遗憾的是到目前为止,其确切发生机制尚未完全阐明。目前治疗角膜新生血管的药物主要有类固醇激素、非甾体抗炎药物、抗VEGF药物、环孢霉素类药物,但这些药物多存在局部或全身毒副作用或者价格昂贵等不足。 二硫氨基甲酸肽吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamte,PDTC)是核因子-κB(muclear factor-KappaB,NF-κB)活化的特异性阻断剂。近年的研究发现,NF-κB在非激活情况下,主要以p50/p65二聚体与NF-κB抑制单位IκB形成的三聚体化合物存在于细胞质中,当细胞受到细胞外刺激时,IκB发生磷酸化及降解,激活的NF-κB(p50/p65二聚体)得以从细胞质进入细胞核,从而促进多种炎症细胞因子及免疫基因的转录,在眼科疾病的发生、发展和转归中起着重要的作用。目前研究表明,PDTC在增生性糖尿病视网膜病变、脉络膜新生血管、肿瘤等疾病的治疗中起着一定的作用。但是PDTC对角膜新生血管的作用少有报道,且PDTC抑制新生血管增生的具体机制尚不明确。 因此,本课题以PDTC为研究对象,采用缝线诱导法建立大鼠角膜新生血管模型,观察不同浓度PDTC对大鼠角膜新生血管的影响,筛选PDTC眼部作用的安全有效浓度；通过免疫组织化学方法检测在PDTC药物作用过程中p65、血管内皮生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在新生血管化角膜中的表达,探讨其可能机制,为临床对角膜新生血管的治疗提供一定的参考。 第一部分观察不同浓度PDTC对大鼠角膜新生血管作用的研究目的 观察局部应用不同浓度PDTC滴眼液对缝线诱导的大鼠角膜新生血管的影响,探讨PDTC的有效安全浓度。 方法 配制相应浓度PDTC滴眼液(1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml)。将48只健康成年雌性SD大鼠随机分成四组,均设定以右眼为实验眼。建立缝线诱导大鼠角膜新生血管模型,并随机分为A组(lmg/ml PDTC滴眼组),B组(2mg/ml PDTC滴眼组),C组(4mg/ml PDTC滴眼组),D组(PBS滴眼组)。各组均于右眼角膜缝线术后第1天开始使用相应不同浓度的滴眼液,每日4次,每次10μl。自缝线术后第1天开始,每日于裂隙灯显微镜下观察各组大鼠角膜新生血管生长情况,于第5、7、14、21天每组随机抽取3只大鼠测量CNV长度,运用公式计算CNV面积并摄影记录。术后第14天,每组随机抽取3只大鼠行角膜组织病理学检查：腹腔注射麻醉,采用颈椎脱臼法处死,手术显微镜下摘除右眼眼球,剪下角膜组织,4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,做4μm连续切片,常规苏木精-伊红染色,以中性树胶封片,光学显微镜下观察并拍照。 结果 1.不同时间点各组CNV面积(mm2):A、B、C组角膜新生血管面积在各时间点均明显小于D组(P0.01)。第5天时,A、B、C组之间两两相比无明显差异(P0.05)；第7天时,A组角膜新生血管面积较B、C组密集,差异有统计学意义(P0.01),B组与C组相比,差异无统计学意义(P0.1)；第14天时,A组角膜新生血管面积大于B、C组,差异有统计学意义(P0.01),B组与C组相比,差异无统计学意义(P0.1)；术后第14天至术后第21天,各组角膜新生血管生长面积变化不明显,差异无统计学意义(P0.1)。 2.组织病理学观察：第14天,A组可见角膜基质层变厚,结构紊乱,较密集新生血管管腔,管腔内可见红细胞附着,全层角膜较密集炎性细胞浸润；B组可见角膜基质层结构整齐,少许新生血管管腔,角膜内少量炎性细胞浸润；C组角膜基质层结构较整齐,新生血管管腔稀疏,角膜全层炎性细胞浸润少；D组角膜水肿增厚,基质层结构不清,大量新生血管管腔,管腔内可见充满红细胞,角膜全层见密集炎性细胞浸润。 结论 大鼠角膜缝线术后局部应用1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml浓度PDTC滴眼液有抑制角膜新生血管的作用；2mg/ml PDTC滴眼液为抑制角膜新生血管的有效安全浓度。 第二部分PDTC抑制大鼠角膜新生血管作用的机制研究 目的 观察局部应用2mg/ml PDTC滴眼液对缝线诱导的大鼠角膜新生血管的抑制作用,检测新生血管化大鼠角膜组织中p65、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,并探讨其意义。方法 65只健康成年雌性SD大鼠,随机抽取5只作为正常对照组,其余60只随机分为A组(2mg/ml PDTC组)、B组(0.1%地塞米松磷酸钠组)、C组(PBS对照组),每组20只。正常对照组不处理,其余实验动物制作大鼠右眼角膜缝线模型,术后分别予2mg/mlPDTC、0.1%地塞米松磷酸钠、PBS缓冲液点右眼,每日4次,每次10μl,连续21天。术后每天在裂隙灯显微镜下观察大鼠角膜新生血管及缝线的变化,在角膜缝线术后第5、7、14、21天分别随机抽取5只大鼠计算各组角膜新生血管面积并摄影记录；于第14天随机取每组5只大鼠,处死后取右眼角膜组织进行角膜组织病理切片观察及免疫组织化学方法检测角膜组织中p65、VEGF和TNF-α的表达。每张切片随机取5个200倍视野计数阳性细胞数并拍照,采用SPSS13.0统计软件分析,计量资料用neans±S.D.表示,各组CNV面积比较用重复测量设计资料的方差分析(Reeated Measure ANOVA)；p65.VECF和TNF-α的表达量用单向方差分析(One-Way ANOVA),以P0.05为差异有统计学意义。 结果 1.不同时间点各组CNV面积(mm2)：A组2mg/ml PDTC组、B组0.1%地塞米松磷酸钠组在5、7、14、21天角膜新生血管面积分别为(5.66±1.07mm2,5.82±1.28mm2)；(11.96±1.87mm2,10.78±2.02mm2)；(13.16±2.35mm2,14.97±1.52mm2):(14.39±2.35mm2,14.98±2.02mm2),各时间点两组相比差异无统计学意义(P0.05)。C组PBS对照组在5、7、14、21天角膜新生血管面积分别为(12.96±2.12mm2)；(21.45±2.78mm2)；(32.34±2.54mm2)；(34.12±1.73mm2),各时间点新生血管面积大于A组与B组,差异有统计学意义(P0.01)。 2.组织病理学观察：大鼠角膜缝线术后第14天,正常角膜可见角膜组织结构清晰,上皮细胞层排列整齐,角膜基质层胶原纤维排列规则,内皮层单层扁平细胞排列有序；A组可见角膜组织结构较整齐,角膜基质层散在新生血管形成,管腔较小,腔内少量红细胞,少量淋巴细胞浸润；B组角膜组织结构趋于完整,实质层散在新生血管,少量淋巴细胞浸润；C组角膜实质层胶原基质肿胀,板层间隙增宽,基质内较密集新生薄壁血管,以中前部为多,管腔内见较多红细胞,角膜实质层大量淋巴细胞浸润。 3.p65.VEGF和TNF-α免疫组织化学图像分析：活化的NF-κB主要在细胞核中以p65形式表达,VEGF和TNF-a表达于胞膜胞浆中。正常对照眼无新生血管,p65、VEGF和TNF-a仅在角膜上皮层和基质层有少量微弱的表达；大鼠角膜缝线术后第14天,A组、B组新生血管稀少,p65、VEGF和TNF-α在角膜上皮层、内皮层及基质层少量表达；C组新生血管密度增高,p65、VEGF和TNF-α表达增多。在各组可观察到p65的表达强度与VEGF和TNF-α的表达强度有着明显的一致性。 4.p65、VEGF和TNF-α免疫组织化学阳性细胞计数：术后14天,各组角膜p65、VEGF和TNF-α阳性细胞计数统计学分析结果表明,各组间p65、VEGF和TNF-α的表达不全相等,A、B、C组较正常角膜组阳性细胞数增多有显著性差异(P0.05),C组p65、VEGF和TNF-α的表达相对A、B组较高(P0.05),但A、B组间比较,角膜p65、VEGF和TNF-α的表达无明显差异(P0.1)。 结论 局部应用PDTC滴眼剂抑制角膜血管新生的机制可能与减少细胞核中p65的表达,降低新生血管化大鼠角膜中VEGF和TNF-α的表达有关。
【关键词】：角膜 新生血管 二硫氨基甲酸肽吡咯烷 核因子-κB 血管内皮生长因子 肿瘤坏死因子-α
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R772.2
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 第一部分 观察不同浓度PDTC对大鼠角膜新生血管作用的研究20-34
• 1 材料20-22
• 2 方法22-24
• 3 结果24-29
• 4 讨论29-34
• 第二部分 PDTC抑制大鼠角膜新生血管作用的机制研究34-49
• 1 材料34-36
• 2 方法36-39
• 3 结果39-45
• 4 讨论45-49
• 全文总结与展望49-50
• 参考文献50-57
• 综述57-68
• 参考文献64-68
• 攻读硕士期间发表的论文68-69
• 致谢69-70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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6 李之U，

本文编号：988901