α-黑素细胞刺激素对谷氨酸诱导的视网膜兴奋性毒性的保护作用

发布时间：2017-10-09 06:25

  本文关键词：α-黑素细胞刺激素对谷氨酸诱导的视网膜兴奋性毒性的保护作用

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【摘要】：背景青光眼、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性是目前全球常见的三种不可逆致盲性眼病,上述疾病在具有各自典型病理过程的同时又存在一种普遍病理状态----视网膜兴奋性神经递质谷氨酸的浓度升高。高浓度谷氨酸会造成视网膜的兴奋性毒性,而文献报道α-黑素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone,α-MSH)可拮抗谷氨酸兴奋性毒性而导致的脑部海马神经元凋亡和胶质细胞反应性增生。目的建立体外鸡胚视网膜组织块培养体系,并利用该体系研究α-MSH对谷氨酸诱导视网膜兴奋性毒性的保护作用;利用出生不久的雏鸡进行玻璃体腔内注射,进一步在体内研究α-MSH对谷氨酸诱导视网膜兴奋性毒性的保护作用。方法体外实验:选取胚胎第9天(E9)的鸡胚视网膜建立组织块培养体系。分别用含10%和15%胎牛血清(FBS)的完全培养基培养组织块,常规苏木精-伊红(HE)染色对比两种条件下视网膜发育情况确定培养条件。然后对此培养条件下的体外培养第3、5、7天(3DIV、5DIV、7DIV)的视网膜组织块及相应的第12、14、16天(E12、E14、E16)的鸡胚视网膜行HE染色,观察各标本的视网膜形态及组织结构。在谷氨酸诱导的兴奋性毒性实验中,将视网膜组织块分为单纯谷氨酸刺激组、α-MSH+谷氨酸刺激组以及正常培养组,谷氨酸处理视网膜组织块24h、48h,CCK-8法检测各组视网膜组织块培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活性;TUNEL染色法检测各组视网膜组织块中细胞凋亡情况并进行定量分析;RT-PCR法检测各组视网膜组织块中各型一氧化氮合酶(eNOS、nNOS、iNOS)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的基因表达。体内试验:选取出生后1天(P1)的雏鸡为研究对象,分成谷氨酸组、α-MSH+谷氨酸组以及正常组,其中α-MSH+谷氨酸组先经玻璃体腔注射α-MSH,谷氨酸组和正常对照组均注射纯水。24h后单纯谷氨酸组以及α-MSH+谷氨酸组行玻璃体腔谷氨酸注射,谷氨酸处理48h后所有动物行ERG检测,然后处死动物取眼球石蜡切片行HE染色,观察视网膜形态及组织结构,TUNEL染色法检测各组视网膜中细胞凋亡情况并进行定量分析。结果体外试验:1.15%FBS相比10%FBS培养条件下,在3DIV时视网膜全层厚度增加(P0.05);5DIV时视网膜外核层(P0.05)、内核层(P0.001)、全层(P0.001)厚度显著增加;7DIV时上述视网膜外核层、内核层、全层厚度在两种培养条件下无差异(P0.05),视网膜组织块中3DIV、5DIV、7DIV各层组织结构与E12、E14和E16的视网膜组织结构相似。2.各组处理24h后,单纯谷氨酸组织块培养基中LDH活性较正常对照组显著增加(P0.001),而α-MSH可阻止这一酶活性增加(P=0.197,α-MSH+谷氨酸刺激组vs正常对照组);处理48h之后,各组LDH活性相比,差异无统计学意义(P0.05)。3.TUNEL染色显示单纯谷氨酸刺激鸡胚视网膜组织24h后视网膜内核层和神经节细胞层细胞出现凋亡;48h后,视网膜内核层和神经节细胞层细胞大量凋亡,外核层亦有少量凋亡细胞,DAPI染色结果表明视网膜各层排列紊乱。α-MSH+谷氨酸刺激组视网膜组织块较单纯谷氨酸刺激组结构明显规整,视网膜各层清晰可见,内核层和节细胞层有少许凋亡细胞。定量结果表明,谷氨酸刺激24h后,各组凋亡细胞总体比较差异有统计学意义(F=12.028,P=0.000)。48h后,各组凋亡细胞总体比较差异有统计学意义(F=1422.890.P=0.000)。单纯谷氨酸刺激组48h凋亡数量为24h的18倍。两时点α-MSH+谷氨酸刺激组凋亡细胞数量均明显少于单纯谷氨酸刺激组,两组比较差异有统计学意义(P=0.000):α-MSH+谷氨酸刺激组视网膜凋亡细胞数量与正常对照组相比,差异无统计学意义(24hP =0.205,48hP =0.640)。4.Real-time PCR结果显示,在处理24h后,单纯谷氨酸处理可使eNOS和GFAP mRNA水平较正常对照组显著上调(P0.01),差异有统计学意义,而α-MSH的加入使eNOS、GFAP和iNOSmRNA水平显著低于单纯谷氨酸处理组(P0.001),差异有统计学意义:48h后α-MSH+谷氨酸刺激组GFAP mRNA水平较单纯谷氨酸刺激组显著下调,差异有统计学意义(P=0.000),但与正常对照组相比差异无统计学意义(P0.05);eNOS、nNOS、iNOSmRNA水平在单纯谷氨酸处理和α-MSH+谷氨酸刺激组之间差异均无统计学意义(P0.05)。体内试验:1.谷氨酸注射处理48h后ERG结果显示:谷氨酸组、α-MSH+谷氨酸组明视ERG的a波潜伏期比正常组缩短(P0.01),而谷氨酸组和α-MSH+谷氨酸组之间明视ERG a波潜伏期差异无统计学意义(P0.05)。谷氨酸组明视ERG a波振幅与正常组相比明显下降(P=0.000),而α-MSH的加入能部分阻止明视ERG a波振幅的下降(P0.01)。明视30Hz闪烁光a波振幅谷氨酸组低于正常组(P0.05),而加入α-MSH后,α-MSH+谷氨酸组与正常组相比差异无统计学意义(P0.05)。2.HE染色显示各组视网膜各层结构清晰,排列整齐,未见视网膜出血、水肿、萎缩及脱离。3.TUNEL染色显示各组凋亡细胞总体比较差异有统计学意义(F=12.028,P=0.000)。α-MSH+谷氨酸组凋亡细胞数量均明显少于谷氨酸组,两组比较差异有统计学意义(P0.01);α-MSH+谷氨酸组视网膜凋亡细胞数量与正常组相比,差异无统计学意义(P=0.061)。结论α-MSH可以在体外、体内减轻谷氨酸诱导的兴奋性毒性对视网膜引起的组织损伤、细胞凋亡和功能损害,这种保护作用可能是通过抑制氮氧化物的产生和胶质细胞反应性增生而实现的。
【关键词】：α-黑素细胞刺激素 视网膜 谷氨酸 兴奋性毒性
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R774
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-14
• 前言14-16
• 研究现状、成果14-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、体外实验16-34
• 1.1 对象和方法16-25
• 1.1.1 实验动物16
• 1.1.2 主要仪器、材料及试剂16-17
• 1.1.3 实验方法17-25
• 1.1.3.1 鸡胚视网膜组织块体外培养的建立与体内视网膜的培养17-18
• 1.1.3.2 鸡胚视网膜组织体外培养与体内发育的形态观察18-19
• 1.1.3.4 体外谷氨酸诱导视网膜兴奋性毒性19-20
• 1.1.3.5 CCK-8检测视网膜组织块培养基中LDH活性20
• 1.1.3.6 TUNEL染色检测视网膜组织块各层细胞凋亡20-21
• 1.1.3.7 RT-PCR检测视网膜组织块NOS、GFAP的基因表达21-25
• 1.2 结果25-30
• 1.2.1 鸡胚视网膜组织块体外培养和相应胚胎发育阶段的形态25-26
• 1.2.2 视网膜组织块培养基中LDH活性26-27
• 1.2.3 视网膜组织块各层细胞凋亡27-29
• 1.2.4 视网膜组织块NOS、GFAP基因表达29-30
• 1.3 讨论30-33
• 1.3.1 鸡胚视网膜组织块培养体系对于完成本研究体外实验的可行性30-31
• 1.3.2 α-MSH在体外对谷氨酸诱导兴奋性毒性的保护作用及机制探讨31-33
• 1.4 小结33-34
• 二、体内实验34-40
• 2.1 对象和方法34-36
• 2.1.1 实验动物34
• 2.1.2 主要仪器、材料及试剂34
• 2.1.3 实验方法34-36
• 2.1.3.1 体内谷氨酸诱导视网膜兴奋性毒性34-35
• 2.1.3.2 ERG检测体内视网膜功能35
• 2.1.3.3 HE染色观察体内视网膜组织形态学改变35
• 2.1.3.4 TUNEL染色检测体内视网膜各层细胞凋亡35
• 2.1.3.5 统计学处理35-36
• 2.2 结果36-39
• 2.2.1 体内视网膜功能变化36
• 2.2.2 体内视网膜组织形态学变化36-37
• 2.2.3 体内视网膜各层细胞凋亡37-39
• 2.3 讨论39
• 2.3.1 α-MSH在体内对视网膜功能及细胞凋亡具有保护作用39
• 2.4 小结39-40
• 全文结论40-41
• 参考文献41-44
• 发表论文和参加科研情况说明44-45
• 综述 缝隙连接在视网膜中的生理功能和视网膜疾病中的作用45-56
• 参考文献52-56
• 致谢56

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本文编号：998649