铂—唑来膦酸配合物的抗肿瘤活性及作用机制研究

发布时间：2017-10-11 22:00

  本文关键词：铂—唑来膦酸配合物的抗肿瘤活性及作用机制研究

  更多相关文章： 铂-唑来膦酸配合物 人胃癌细胞SGC7901 细胞周期阻滞 凋亡 法尼醇

【摘要】：目的探讨铂-唑来瞵酸配合物{[Pt(en)]2ZL}对多种肿瘤细胞的抗肿瘤活性,并初步研究该化合物抑制人胃癌细胞SGC7901增殖的可能机制。方法运用传统MTT方法来测定{[Pt(en)]2ZL}所影响的多种肿瘤细胞存活率,以及后期加入FOH时的肿瘤细胞存活率变化。平板克隆实验用于检测{[Pt(en)]2ZL}对人胃癌细胞SGC7901增殖情况的影响。细胞衰老半乳糖苷酶染色与免疫荧光染色分别用来观察此配合物引起的SGC7901衰老及微管动态平衡方面的改变。选用适当的荧光染色(PI单染、Hochest 33342/PI荧光双染、JC-1单染、TUNEL实验、Annexin V/PI双染)进行荧光显微镜观察及流式细胞仪定量分析{[Pt(en)]2ZL}及法尼醇(FOH)的加入对SGC7901细胞周期和凋亡的影响。AO荧光染色可用于观察此配合物引起的细胞自噬相关形态学变化。Western blot可用于半定量观测{[Pt(en)]2ZL}所引起的细胞周期相关蛋白(p53、p21、Cyclin D1, Cyclin E和CDK2),细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2,Bax,caspase 3,PARP及survivin),细胞自噬相关蛋白LC3以及小G蛋白家族相关蛋白(Ras和RhoA)的表达水平的变化。结果{[Pt(en)]2ZL}对多种肿瘤细胞具有良好的抗肿瘤活性(如：对胃癌细胞SGC7901和MGC803的IC50值分别为25.15±0.75和38.52±3.00μM),且目前对人胃癌细胞SGC7901最为显著,并观察到胃癌细胞在药物作用后会出现衰老及微管动态平衡形态及功能方面的改变,并进一步检测到其细胞周期阻滞在G1/S期(99.99%),且细胞周期调控相关蛋白(p53.p21.Cyclin E和CDK2表达水平上调,Cyclin D1的表达水平下调)的表达水平也相应改变。与此同时,在荧光染色下SGC7901也出现了明显的凋亡形态和功能变化,而Annexin V/PI双染更能定量观测到凋亡发生的比例(早凋和晚凋的比例分别可升至20.5%和25.3%),.且细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2,caspase 3酶原,PARP酶原及survivin表达水平下调,Bax及剪切后PARP表达水平上调)的表达水平亦发生变化。而FOH的加入,可以削弱{[Pt(en)]2ZL}引起的细胞增殖抑制(IC50值升至84.43±4.04μM)、细胞周期阻滞(G2/M期升至9.17±1.12%)和凋亡(早凋和晚凋的比例分别降至6.12±3.51%和5.36±0.53%),并引起小G蛋白家族(Ras和RhoA酶原表达水平下调,非异戊烯化的Ras和RhoA表达水平上调)的表达水平的变化。另外,AO荧光染色及LC3蛋白表达水平的检测发现{[Pt(en)]2ZL}可引起SGC7901发生自噬相关的形态和分子水平方面的改变。结论铂-唑来膦酸配合物{[Pt(en)]2ZL}对多种肿瘤细胞具有良好的抗肿瘤活性,尤以对人胃癌细胞SGC7901较为突出。目前的研究表明{[Pt(en)]2ZL}对人胃癌细胞SGC7901通过细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡发挥良好的抗增殖活性。其中G1/S期阻滞与化合物对细胞周期调节网络中的p53-p21-Cyclin D支路的调节相关。而诱导细胞凋亡可能与caspase级联反应以及胞内PARP相关凋亡活动的激活相关。另外,FOH以及细胞自噬均有可能在{[Pt(en)]2ZL}所引起抗肿瘤活性中发挥重要作用。由此可知,{[Pt(en)]2ZL}在治疗胃癌方面,可以成为一种具有优良抗肿瘤潜力的化疗药物。
【关键词】：铂-唑来膦酸配合物 人胃癌细胞SGC7901 细胞周期阻滞 凋亡 法尼醇
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中英文对照表8-10
• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 前言14-20
• 参考文献17-20
• 第一部分 铂-唑来膦酸配合物对肿瘤细胞的增殖影响20-32
• 引言20
• 材料与方法20
• 1 材料20-22
• 1.1 细胞株与铂-唑来膦酸配合物20
• 1.2 仪器20-21
• 1.3 试剂21
• 1.4 常用缓冲液配制21-22
• 2 实验方法22-24
• 2.1 细胞培养和处理22-23
• 2.2 细胞存活率的测定23
• 2.3 平板克隆形成实验23-24
• 2.4 统计学处理24
• 3 实验结果24-29
• 3.1 {[Pt(en)]_2ZL}对肿瘤细胞增殖的影响24-27
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}对人胃癌细胞SGC7901的细胞毒性研究27-28
• 3.3 {[Pt(en)]_2ZL}对人胃癌细胞SGC7901形成细胞克隆能力的影响28-29
• 讨论29-30
• 结论30-31
• 参考文献31-32
• 第二部分 铂-唑来膦酸配合物对人胃癌细胞SGC7901周期的影响32-48
• 引言32-33
• 材料与方法33
• 1 材料33-36
• 1.1 细胞株(参见第一部分)33
• 1.2 仪器33-34
• 1.3 试剂34
• 1.4 常用缓冲液的配制34-36
• 2 实验方法36-41
• 2.1 流式细胞术检测细胞周期分布36-37
• 2.2 细胞衰老半乳糖苷酶染色37
• 2.3 免疫荧光染色观测微管结构37
• 2.4 Western Blot法37-41
• 2.5 统计学处理(实验方法参见第一部分)41
• 3 实验结果41-45
• 3.1 {[Pt(en)]_2ZL}对人胃癌细胞SGC7901细胞周期分布的影响41-42
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}对人胃癌细胞SGC7901衰老的影响42-43
• 3.3 {[Pt(en)]_2ZL}对人胃癌细胞SGC7901的微管动态平衡的影响43
• 3.4 {[Pt(en)]_2ZL}影响人胃癌细胞SGC7901内细胞周期相关蛋白的表达43-45
• 讨论45-46
• 结论46
• 参考文献46-48
• 第三部分 铂-唑来膦酸配合物对人胃癌细胞SGC7901凋亡的影响48-62
• 引言48-49
• 材料与方法49
• 1 材料49-50
• 1.1 细胞株(参见第一部分)49
• 1.2 仪器(参见第二部分)49
• 1.3 试剂49-50
• 1.4 常用缓冲液的配制50
• 2 实验方法50-52
• 2.1 Hoechst 33342/PI双染50-51
• 2.2 线粒体膜电位检测51
• 2.3 TUNEL染色法检测细胞凋亡51
• 2.4 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测51-52
• 2.5 Western Blot法(实验方法参见第二部分)52
• 2.6 统计学处理(实验方法参见第一部分)52
• 3 实验结果52-58
• 3.1 Hoechst/PI双染对细胞凋亡形态的评价52-53
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}对人胃癌细胞SGC7901线粒体膜电位的影响53-54
• 3.3 TUNEL法检测细胞凋亡54-55
• 3.4 Annxin V-FITC/PI细胞凋亡检测盒检测凋亡发生率55-56
• 3.5 {[Pt(en)]_2ZL}影响人胃癌细胞SGC7901内细胞凋亡相关蛋白的表达56-58
• 讨论58-60
• 结论60
• 参考文献60-62
• 第四部分 铂-唑来膦酸配合物对人胃癌细胞SGC7901中甲羟戊酸途径的影响62-73
• 引言62
• 材料与方法62
• 1 材料62-63
• 1.1 细胞株(参见第一部分)63
• 1.2 仪器(参见第二部分)63
• 1.3 试剂63
• 1.4 常用缓冲液的配制63
• 2 实验方法63
• 2.1 FOH和GGOH对{[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌细胞SGC7901存活率的影响(实验方法参见第一部分)63
• 2.2 流式细胞术检测细胞周期分布(实验方法参见第二部分)63
• 2.3 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测(实验方法参见第三部分)63
• 2.4 Western Blot法(实验方法参见第二部分)63
• 2.5 统计学处理(实验方法参见第一部分)63
• 3 实验结果63-69
• 3.1 FOH和GGOH对{[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌细胞SGC7901存活率的影响63-65
• 3.2 FOH对{[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌细胞SGC7901细胞周期阻滞的影响65
• 3.3 FOH对{[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌细胞SGC7901细胞凋亡的影响65-67
• 3.4 FOH对{[Pt(en)]_2ZL}引起的人胃癌细胞SGC7901细胞周期和细胞凋亡相关蛋白表达水平变化的影响67-68
• 3.5 {[Pt(en)]_2ZL}可影响人胃癌细胞SGC7901内小G蛋白家族中Ras和RhoA蛋白的表达水平68-69
• 讨论69-71
• 结论71
• 参考文献71-73
• 第五部分 铂-唑来膦酸配合物对人胃癌细胞SGC7901中自噬途径的影响73-79
• 引言73
• 材料与方法73
• 1 材料73-74
• 1.1 细胞株(参见第一部分)73
• 1.2 仪器(参见第二部分)73
• 1.3 试剂73-74
• 1.4 常用缓冲液的配制74
• 2 实验方法74
• 2.1 AO荧光染色74
• 2.2 Western Blot法(实验方法参见第二部分)74
• 2.3 统计学处理(实验方法参见第一部分)74
• 3 实验结果74-76
• 3.1 {[Pt(en)]_2ZL}对人胃癌细胞SGC7901自噬的影响74-75
• 3.2 {[Pt(en)]_2ZL}对人胃癌细胞SGC7901内自噬相关蛋白LC3的表达水平的影响75-76
• 讨论76-77
• 结论77
• 参考文献77-79
• 综述79-89
• 参考文献85-89
• 攻读学位期间发表文章情况89-90
• 致谢90-91

【参考文献】

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本文编号：1014953