益气活血中药配伍联合双抗抗血小板的作用与机制研究

发布时间：2017-10-13 02:26

  本文关键词：益气活血中药配伍联合双抗抗血小板的作用与机制研究

  更多相关文章： 益气活血 西洋参茎叶总皂甙 三七总皂苷 血小板 内皮 胃粘膜

【摘要】：阿司匹林(Aspirin, ASA)和氯吡格雷(Clopidogrel.CLP)组成的双联抗血小板(Dual antiplatelet therapy)是急性冠脉综合症(Acute coronary syndrome,ACS)患者经皮冠状动脉介入术(Percutaneous coronary intervention, PCI)后一年内的常规治疗方案。ASA不可逆地乙酰化血小板环氧化酶-1(Cyclooxygenase-1, COX-1),减少血栓素(Thromboxane, TXA2)产生,抑制花生四烯酸(Arachidonic acid, AA)诱导的血小板活化,但对凝血酶、二磷酸腺苷(Adenosinediphosphate, ADP)等其他诱导剂诱导的血小板活化的抑制作用较弱；CLP特异性地、不可逆地阻断血小板P2Y12受体,抑制其下游PI3K/Akt通路,抑制血小板聚集。与单用ASA或CLP相比,双抗具有更好的抗血小板作用,但ACS患者PCI后即使长期服用双抗,1年内血栓事件发生率仍达7.4%-16.5%；同时,仍有1.3%的患者在30天内出现消化道出血。因此,如何有效抑制血小板活化,同时又可减少双抗引起的胃粘膜损伤,是目前面临的挑战。内皮-血小板粘附是动脉血栓形成的始动环节。内皮损伤可诱导血小板粘附活化,活化的血小板又可加重内皮损伤,促进血栓形成。ASA抑制血管局部COX,可导致损伤内皮的修复延迟；CLP可抑制PI3K/Akt通路,促进内皮细胞凋亡。双抗是否会影响内皮细胞损伤诱导的血小板粘附和活化,目前尚缺乏报道。胃粘膜上皮细胞COX-1和COX-2均可介导前列腺素E2 (Prostaglandin E2, PGE2)和前列环素(Prostaglandin I2, Prostacyclin, PGI2)的合成。PGE2促进胃粘膜上皮细胞增生,增强胃粘膜上皮细胞连接,维持胃粘膜上皮细胞正常的通透性；PGI2改善局部血液循环,促进损伤胃粘膜的修复。ASA和CLP均可直接诱导胃粘膜上皮细胞凋亡和通透性升高。GTP-结合蛋白RhoA对细胞间连接蛋白的表达和细胞通透性的维持具有重要作用,PI3K/Akt通路作为RhoA的上游通路,可减轻RhoA介导的细胞通透性升高。双抗对胃粘膜上皮细胞的损伤机制是否与胃粘膜上皮细胞COX/前列腺素(Prostaglandins, PGs)通路和PI3K/Akt/RhoA通路有关,亦未见有研究报道。西洋参和三七配伍是益气活血的常用配伍之一,被广泛应用于冠心病等血栓性疾病的治疗。既往研究证实,益气活血中药联合双抗和单用双抗相比,可显著降低PCI术后患者的血栓事件发生率,且不增加出血风险。西洋参茎叶总皂苷(Panax quinquefolium saponin, PQS)作为上市中成药,在国内用于冠心病治疗近20年,临床试验证明,PQS可显著减轻冠心病心绞痛症状和缺血心电图改变。实验研究显示,PQS可上调内皮细胞P13K/Akt通路蛋白表达,减轻内皮细胞氧化应激损伤。PQS联合双抗可以降低心肌梗死大鼠血清内皮素(Endothelin-1, ET-1)浓度,升高血清一氧化氮(Nitric oxide, NO)浓度。三七总皂苷(Panax notoginseng saponin, PNS)可减轻内皮细胞氧化应激损伤,抑制ADP或胶原诱导的血小板活化。PNS联合双抗与单用双抗相比,可以显著降低PCI术后1年内心血管事件发生率,但目前尚缺乏关于PNS与ASA在抗血小板方面的比较研究。既往研究证实PNS可上调人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)内PI3K/Akt/GSK-3β通路蛋白表达,减轻细胞凋亡。PNS对双抗诱导的胃粘膜上皮细胞凋亡和通透性升高有何作用,其机制是否也涉及PI3K/Akt/RhoA通路和COX通路,以往尚缺乏研究。围绕以上问题,本研究提出如下假说：(1)在双抗基础上联用PQS或PNS,可进一步抑制内皮损伤诱导的血小板粘附和活化；(2)PQS联合双抗可通过调节PI3K/Akt通路发挥内皮细胞保护作用；(3)PNS可抑制内皮损伤诱导的血小板活化,机理可能涉及对内皮细胞和血小板COX通路的抑制；(4)PNS通过调节胃粘膜上皮细胞COX/PGs、PI3K/Akt/RhoA和PI3K/Akt/GSK-3β通路,减轻双抗诱导的胃粘膜上皮细胞凋亡和通透性升高。针对以上假说,本研究进行三部分研究：实验一益气活血中药有效部位联合双抗对内皮损伤诱导血小板粘附的影响目的：观察PQS+双抗、PNS+双抗及PQS与PNS配伍联合双抗对内皮损伤诱导的血小板粘附的作用,并从PI3K/Akt、COX-2/6-keto-PGFlα和COX-1/TXB:通路探讨其机制。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell, HUVEC),加入氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)(终浓度：80 mg/L)干预HUVEC 16h,建立HUVEC损伤模型。损伤的HUVEC随机分为模型组、双抗组(ASA15μg/ml+氯吡格雷10μg/ml)、PQS (160μg/ml)+双抗组,PNS (160μg/ml)+双抗组,PQS (160μg/ml)+PNS (160μg/ml)+双抗组及P13K特异性抑制剂(LY294002,30μg/ml)+PQS+双抗组,同时设空白组作为对照。造模16h后,HUVEC中加入静息血小板共同孵育5min。流式细胞术检测HUVEC凋亡率、血小板粘附程度和血小板CD62p表达；放免法检测HUVEC上清液中6-keto-PGFla和TXB2浓度；Western-blot检测HUVEC和血小板中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、COX-1、COX-2的蛋白表达。结果：与空白组比较,模型组HUVEC凋亡率、血小板粘附、血小板CD62p表达均升高(P0.05),细胞培养上清液中6-keto-PGFla浓度、TXB2浓度均升高(P0.05),HUVEC中p-Akt蛋白表达降低、COX-2蛋白表达升高(P0.05),血小板中p-Akt蛋白表达升高(P0.05)。与模型组比较,双抗组血小板粘附、血小板CD62p表达均降低(P0.05),HUVEC凋亡率无显著变化(P0.05),细胞培养上清液中6-keto-PGFla浓度、TXB2浓度均降低(P0.05),HUVEC中COX-2蛋白表达降低(P0.05), p-Akt蛋白表达无明显变化(P0.05),血小板中p-Akt蛋白表达降低(P0.05)。与双抗组比较,PQS+双抗组血小板粘附、HUVEC凋亡率均降低(P0.05),血小板CD62p表达无明显变化(P0.05),上清液6-keto-PGFla浓度升高(P0.05),HUVEC p-Akt蛋白表达升高(P0.05)；加入LY294002后,HUVEC凋亡率、血小板粘附均升高(P0.05)。与双抗组相比,PNS+双抗组血小板粘附.HUVEC凋亡率均降低(P0.05),血小板CD62P表达无明显改变(P0.05),上清液6-keto-PGFla浓度升高(P0.05),HUVEC中COX-2蛋白表达升高(P0.05),血小板COX-1蛋白表达降低(P0.05)。与PQS+双抗组比较,PQS+PNS+双抗组内皮细胞凋亡率、血小板粘附和CD62p表达均降低(P0.05),血小板COX-1蛋白表达降低(P0.05)。与PNS+双抗组比较,PQS+PNS+双抗组内皮细胞凋亡率和血小板粘附均降低(P0.05), CD62p表达无明显改变(P0.05)。结论：PQS联合双抗或PNS联合双抗均可抑制内皮细胞凋亡和内皮损伤诱导的血小板粘附,PQS与PNS配伍联合双抗,效果更显著,其机制涉及对内皮细胞PI3K/Akt通路、C0X-2/PGL通路的促进和对血小板PI3K/Akt通路、C0X-l/TXA2通路的抑制。实验二：三七总皂苷对内皮损伤诱导血小板粘附的作用与机制研究目的：观察PNS和ASA对ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡及凋亡内皮细胞诱导的血小板活化和粘附的作用,并从COX通路探讨其机制。方法：体外培养HUVEC,加入ox-LDL(终浓度：80 mg/L)干预HUVEC 16h建立HUVEC损伤模型。损伤的HUVEC随机分为模型组,ASA组(15μg/ml),PNS组(160μg/ml),同时设置空白组作为对照。造模16h后,HUVEC中加入静息血小板共同孵育5min。流式细胞术检测HUVEC凋亡率、血小板粘附和血小板CD62p表达,放免法检测细胞培养上清液6-keto-PGFla和TXB2水平,Western-blot检测HUVEC和血小板中COX-1、COX-2蛋白表达。结果：与空白组相比,模型组HUVEC凋亡率、血小板粘附、血小板CD62p表达均显著升高(P0.05),细胞培养上清液6-keto-PGF1a和TXB2水平均升高(P0.05)。与模型组比较,ASA组HUVEC凋亡率升高,血小板粘附和血小板CD62p表达均降低(P0.05),细胞培养上清液6-keto-PGF1a和TXB：水平均降低(P0.05)。与ASA组比较,PNS组HUVEC凋亡率和血小板粘附均显著降低(P0.05),细胞培养上清液6-keto-PGF1a水平升高(P0.05), TXB2水平降低(P0.05),HUVEC中COX-2蛋白表达升高(P0.05),血小板COX-1蛋白表达降低(P0.05)。结论：ASA与PNS均可抑制内皮损伤诱导的血小板粘附与活化,其中与ASA相比,PNS抑制血小板粘附的作用更显著,其机制涉及PNS对血小板COX-1/TXA2通路的抑制和对内皮细胞COX-2/PGI2通路的促进作用。实验三：三七总皂苷对双抗引起的胃粘膜上皮细胞损伤的影响目的：观察PNS对双抗诱导的胃粘膜上皮细胞凋亡和通透性升高的影响,并从COX通路和PI3K/Akt通路探讨其作用机制。方法：体外培养人胃粘膜上皮细胞(GES-1),随机分为空白组、双抗组、PNS+双抗组.LY294002+PNS+双抗组。流式细胞术检测GES-1凋亡率,酶标仪测定GES-1细胞通透性,放免法检测GES-1细胞培养上清液PGE2、6-keto-PGFla浓度,ELISA法检测GES-1细胞培养上清液血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)浓度。Western-blot检测GES-1中COX-1、COX-2、PI3K、 p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、RhoA、GTP-RhoA蛋白表达。结果：与空白组比较,双抗组GES-1凋亡率、通透性均显著升高(P0.05),PGE2、 6-keto-PGFla和VEGF浓度均降低(P0.05), COX-1、p-PI3K、p-Akt蛋白表达均降低(P0.05), COX-2、GTP-RhoA、GSK-3β蛋白表达均升高(P0.05)。与双抗组比较,PNS+双抗组GES-1凋亡率与通透性均降低(P0.05),PGE2、6-keto-PGF1 a和VEGF浓度均升高(P0.05),COX-1、p-PI3K、p-Akt蛋白表达均升高(P0.05),COX-2、GTP-RhoA、GSK-3β蛋白表达均降低(P0.05);加入LY294002后,COX-1和COX-2蛋白表达无影响(P0.05),GES-1凋亡率和通透性均显著升高(P0.05),GTP-RhoA及GSK-3β蛋白表达均升高(P0.05)。结论：PNS可以减轻双抗对胃粘膜上皮细胞中COX/PG通路的抑制,减轻双抗诱导的胃粘膜上皮细胞凋亡和通透性升高,机制涉及对胃粘膜上皮细胞PI3K/Akt/GSK-3β-VEGF-RhoA通路的调节。
【关键词】：益气活血 西洋参茎叶总皂甙 三七总皂苷 血小板 内皮 胃粘膜
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
【目录】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-13
• 英文缩略词表13-15
• 第一部分 文献综述15-41
• 综述一 中西医结合抗血小板治疗进展15-30
• 综述二 阿司匹林、氯吡格雷致胃粘膜损伤机理与中医药防治研究进展30-34
• 参考文献34-41
• 前言41-48
• 参考文献43-48
• 第二部分 实验研究48-93
• 实验一 益气活血中药有效部位联合双抗对内皮损伤诱导血小板粘附的影响48-69
• 材料和方法48-52
• 结果52-58
• 讨论58-63
• 结论63-64
• 参考文献64-69
• 实验二 三七总皂苷对内皮损伤诱导血小板粘附的作用与机制研究69-80
• 材料和方法69-70
• 结果70-75
• 讨论75-77
• 结论77-78
• 参考文献78-80
• 实验三 三七总皂苷对双抗引起的胃粘膜上皮细胞损伤的影响80-93
• 材料和方法80-82
• 结果82-86
• 讨论86-89
• 结论89-90
• 参考文献90-93
• 结论93-94
• 致谢94-95
• 个人简历95-96

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈万琪,沈一负,熊太平,徐清云,彭延风,龙军爱;卵黄与猪血水两种双抗琼脂平板培养基检出脑膜炎双球菌的比较[J];湖南医学;1987年06期

2 樊得英;冯若飞;李向茸;张海霞;凡静静;沈心亮;马忠仁;;脑心肌炎病毒抗体双抗原夹心ELISA检测方法的建立及初步应用[J];中国生物制品学杂志;2012年01期

3 张瑞镐,薛德义;抗HBs的双抗原夹心BA-ELISA检测和应用[J];上海免疫学杂志;1989年06期

4 王璋瑜;;单抗之后双抗将接踵而来吗?[J];生物技术通报;1991年01期

5 陈晓钎;双特异性单克隆抗体的再导向细胞毒作用研究[J];国外医学.输血及血液学分册;1997年06期

6 肖冰,金迎春,王春;双抗胶原膜引导牙周组织再生术患者的护理[J];护理学杂志;2005年14期

7 汪志辉,侯梦芹,陈霞,陈锦生,钟永荣;双抗原酶斑点-ELISA快速检测幽门螺杆菌抗体的研究[J];海峡预防医学杂志;2005年05期

8 刘萱,李平,石玉玲,易艳萍,任冽,匡铁吉,段昭辉,王云龙,马清钧,曹诚;临床应用重组SARS病毒双抗原夹心诊断试剂盒的检测效果评价[J];病毒学报;2004年02期

9 张帅清;;影响双抗原夹心ELISA法检测HIV抗体因素研究[J];中国卫生检验杂志;2008年02期

10 额尔敦,其其格,郭美香,韩玲,刘士山,张丽民,陈杞,张庆荣;双抗HBsAg抗体夹心时间分辨免疫荧光分析方法的建立[J];中国免疫学杂志;1999年11期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 詹林盛;李保昌;孙萍;杨淑华;王全立;;生物素化HCV多表位融合抗原的表达及其在双抗原夹心检测方法中的应用[A];中国输血协会第四届输血大会论文集[C];2006年

中国重要报纸全文数据库 前1条

1 本报记者 宋逊风;双抗杂交棉凸显优势[N];农民日报;2002年

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 黄龙江;金银花抗病毒有效成分双抗素类似物的合成研究[D];中国协和医科大学;2006年

2 李弟灶;金银花抗病毒有效成分双抗素类似物的合成与活性研究[D];中国协和医科大学;2008年

3 汤雁波;金银花抗病毒有效成分双抗素类似物的合成与活性研究[D];中国协和医科大学;2007年

中国硕士学位论文全文数据库 前6条

1 谢诚;冠心病患者药物洗脱支架置入术后双抗血小板疗程的系统评价[D];苏州大学;2015年

2 寇娜;益气活血中药配伍联合双抗药物抗血栓作用及出血风险研究[D];北京中医药大学;2016年

3 王铭铭;益气活血中药配伍联合双抗抗血小板的作用与机制研究[D];中国中医科学院;2016年

4 李德志;丙型肝炎病毒抗体的双抗原夹心检测方法的初步建立[D];河南师范大学;2014年

5 康彦红;PON1遗传及表观遗传变异与双抗抗血小板治疗临床效应的相关性研究[D];南方医科大学;2013年

6 葛云皓;短期双重抗血小板治疗短暂性脑缺血发作疗效及安全性观察与预测[D];吉林大学;2015年

，

本文编号：1022319