烯啶虫胺对人骨髓间充质干细胞的遗传毒性研究

发布时间：2017-10-13 22:45

  本文关键词：烯啶虫胺对人骨髓间充质干细胞的遗传毒性研究

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【摘要】：烯啶虫胺是一种新烟碱杀虫剂,对哺乳动物低毒,因此在农业、水产养殖和家居生活等领域广泛应用。但最近毒理学研究表明新烟碱杀虫剂对非靶标生物产生毒性作用,对生态环境、哺乳动物乃至人类健康构成潜在危害。目前烯啶虫胺对于非靶标生物的毒性机制尚不清楚,未见烯啶虫胺对人细胞毒性的相关报道。采用人骨髓间充质干细胞(Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, hBMSCs)作为检测体系能够有效提高化学品安全性评价结果的准确性及与人体健康的相关性,并有利于提高测试效率和确定毒性机制。本研究的目的是利用体外hBMSCs培养方法,探讨烯啶虫胺的遗传毒性和作用机制,并确定早期遗传毒性生物标志物。烯啶虫胺以0-2500 μg/mL暴露hBMSCs,采用水溶性甲瓒法检测细胞存活率,结果表明细胞存活率和增殖没有显著的抑制作用。用体外微核实验检测烯啶虫胺对hBMSCs的DNA损伤,用Annexin-FITC法检测烯啶虫胺对hBMSCs的细胞凋亡,结果显示烯啶虫胺暴露导致细胞微核率和核芽升高,具有剂量-效应关系。烯啶虫胺浓度大于125 μg/mL时细胞微核率显著高于阴性对照组,该浓度低于产生凋亡小体的浓度,从而排除凋亡小体对微核计数的干扰。阐明烯啶虫胺对hBMSCs造成DNA损伤作用,具有潜在的遗传毒性。通过活性氧、总抗氧化能力和超氧岐化酶检测烯啶虫胺对hBMSCs氧化应激水平,发现暴露浓度大于250 μg/mL时活性氧含量显著增加,总抗氧化能力下降,超氧岐化酶活力异常。此外,通过碱性磷酸酶测定和茜素红染色评估烯啶虫胺对hBMSCs诱导成骨分化能力,结果表明碱性磷酸酶活性显著下降并且茜素红对钙化结节染色下降,烯啶虫胺暴露对hBMSCs成骨分化产生抑制作用。进一步,利用荧光定量PCR方法检测烯啶虫胺对hBMSCs DNA损伤应答通路基因表达变化,结果发现ATM、ATR、 p53、p21、Gadd45a、H2AX和Bax基因发生差异表达。综上,本研究发现烯啶虫胺对人骨髓间充质干细胞具有遗传毒性损伤,DNA损伤应答通路上的ATM和p53基因对DNA损伤进行调控。DNA损伤使细胞内活性氧升高,总抗氧化能力下降,导致细胞氧化还原体系失衡,影响细胞成骨分化。研究结果提示hBMSCs模型是一种良好的遗传毒性动物实验替代方法,利用早期生物标志物,有助于预测和评估外源化学物对于人体的潜在危害。
【关键词】：人骨髓间充质干细胞 遗传毒性 烯啶虫胺 新烟碱类杀虫剂 毒性机制
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R99
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1 绪论11-25
• 1.1 新烟碱类杀虫剂11-14
• 1.1.1 新烟碱类杀虫剂对昆虫的毒性效应与作用机制11-12
• 1.1.2 新烟碱类杀虫剂对非靶标生物的毒性效应12
• 1.1.3 一种典型新烟碱类杀虫剂—烯啶虫胺12-14
• 1.2 化学品毒性体外测试方法14-20
• 1.2.1 动物实验替代方法的发展14-18
• 1.2.2 干细胞在体外毒性检测中的应用18-19
• 1.2.3 遗传毒性体外测试方法19-20
• 1.3 毒性作用模式与毒性作用机制20-24
• 1.3.1 毒性作用模式21-22
• 1.3.2 遗传毒性作用机制22-24
• 1.4 本文主要研究思路24-25
• 2 材料与方法25-35
• 2.1 实验试剂25-26
• 2.2 实验仪器26
• 2.3 人骨髓间充质干细胞培养26-29
• 2.4 细胞增殖检测29
• 2.5 水溶性甲瓒法(WST-8)检测细胞存活率29
• 2.6 鼠肝微粒体酶(S9)体外活化系统制备29
• 2.7 细胞暴露29-30
• 2.8 微核实验30
• 2.9 Annexin V-FITC/PI凋亡检测实验30
• 2.10 氧化应激实验30-31
• 2.11 hBMSCs诱导成骨分化31
• 2.12 细胞总RNA提取31-32
• 2.13 反转录得到cDNA32
• 2.14 Realtime-qPCR检测DNA损伤应答通路关键基因表达32-34
• 2.15 数据分析34-35
• 3 遗传毒性测试阳性对照物——甲磺酸甲酯对hBMSCs的毒性35-44
• 3.1 甲磺酸甲酯对hBMSCs的细胞毒性和遗传毒性35-38
• 3.1.1 甲磺酸甲酯对hBMSCs的细胞毒性36
• 3.1.2 甲磺酸甲酯对hBMSCs的遗传毒性36-38
• 3.2 甲磺酸甲酯对hBMSCs DNA损伤通路关键基因的影响38-43
• 3.2.1 引物验证39
• 3.2.2 MMS对hBMSCs的DNA损伤通路关键基因的影响39-43
• 3.3 小结43-44
• 4 烯啶虫胺对hBMSCs的遗传毒性效应44-60
• 4.1 烯啶虫胺对hBMSCs的细胞毒性44-46
• 4.1.1 烯啶虫胺对hBMSCs的细胞存活率的影响44-45
• 4.1.2 烯啶虫胺对hBMSCs凋亡率的影响45-46
• 4.2 烯啶虫胺对hBMSCs的遗传毒性46-53
• 4.2.1 烯啶虫胺对hBMSCs的遗传毒性47-48
• 4.2.2 烯啶虫胺经体外活化代谢后对hBMSCs的遗传毒性48-50
• 4.2.3 农用烯啶虫胺混剂对hBMSCs的遗传毒性50-53
• 4.3 烯啶虫胺对hBSMCs氧化应激的影响53-57
• 4.3.1 烯啶虫胺对hBMSCs活性氧的影响53-54
• 4.3.2 烯啶虫胺对hBMSCs总抗氧化能力的影响54-56
• 4.3.3 烯啶虫胺对hBMSCs超氧岐化酶的影响56-57
• 4.4 烯啶虫胺对hBMSCs的成骨分化的影响57-59
• 4.5 小结59-60
• 5 烯啶虫胺对hBMSCs的DNA损伤通路上关键基因表达的影响60-66
• 5.1 ATM和ATR基因表达变化60-61
• 5.2 p53和Bax基因表达变化61-62
• 5.3 p21和Gadd45a基因表达变化62-63
• 5.4 H2AX基因表达变化63-65
• 5.5 小结65-66
• 结论66-67
• 参考文献67-73
• 附录A hBMSCs表面分子鉴定73-74
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况74-75
• 致谢75-76

【参考文献】

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本文编号：1027520