一种发形霞水母来源多肽生长因子的生物学活性研究

发布时间：2017-10-14 06:18

  本文关键词：一种发形霞水母来源多肽生长因子的生物学活性研究

  更多相关文章： 水母 触手提取物 多肽生长因子 血管内皮生长因子 促增殖活性 信号通路

【摘要】：本课题组致力于发形霞水母(Cyanea capillata,C.capillata)来源的活性物质及相关机理研究多年。以往研究中,我们发现水母触手表现出超强创伤修复能力,且触手中刺细胞具有快速增殖的特点,提示水母触手中可能存在高活性促生长因子。在分析C.capillata触手提取物(tentacle extract,TE)的细胞活性时也观察到一个有趣现象,即低浓度的T E可以诱发细胞增殖。结合相关文献报道,我们推测TE中含有类似促增殖活性物质。本课题组前期建立了C.capillata触手组织c DNA文库,分析发现其中有四条血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)类似序列,为我们从TE中提取促生长活性物质提供了重要理论依据。组合应用多种分离技术,我们成功从TE中分离得到具有促生长活性的一个颗粒蛋白样多肽生长因子并命名为Cc GRN-1(Cyanea capillata granulin-1,Cc GRN-1)。因此,本课题将重点研究TE和Cc GRN-1的促生长活性及其作用机制。通过本课题的研究,我们希望可以为将来某些特殊疾病或环境造成的伤口难愈合情况提供新的治疗思路。方法第一部分:TE的生物学活性研究首先,采用CCK-8法检测TE对HUVECs细胞活力的影响。然后,通过流式细胞术检测TE对HUVECs细胞周期进程的影响;并检测其对细胞周期相关蛋白Cyclin B1和Cyclin D1表达的影响。随后,采用Western Blotting检测TE对HUEVCs中生长相关信号通路的级联情况,包括PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK,JNK MAPK,p38 MAPK和NF-κB通路以及下游caspase-3,8,9和Cyto C蛋白的表达水平;同时,采用免疫荧光技术对信号通路的级联情况进一步验证。随后,选择TE激活的信号通路对应的抑制剂,检测其对细胞周期蛋白表达的影响。最后,采用划痕修复实验检测TE对细胞迁移能力的影响。第二部分:Cc GRN-1的生物学活性研究首先,采用CCK-8法检测Cc GRN-1对HUVECs的细胞活力的影响。其次,通过流式细胞术检测Cc GRN-1对HUVECs细胞周期进程的影响,并检测细胞周期相关蛋白Cyclin B1和Cyclin D1的表达变化情况。然后,采用Western Blotting检测Cc GRN-1对HUEVCs中生长相关信号通路的级联情况,主要包括PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK,JNK MAPK和NF-κB通路;同时,采用免疫荧光技术对信号通路的级联情况做进一步的验证。随后,选择Cc GRN-1激活的信号通路对应的抑制剂,检测其对细胞周期蛋白表达的影响。最后,采用划痕修复实验检测Cc GRN-1的促细胞迁移能力。同时,选取商品化血管内皮生长因子VEGF作为对照,并行分析其与Cc GRN-1的生物学活性及作用机制。结果第一部分:TE的生物学活性研究CCK-8法检测结果显示,高剂量TE抑制细胞生长,使HUVECs细胞活力呈剂量依赖性降低;而低剂量TE可以促进细胞活力明显升高。此外,流式细胞术结果显示,TE可以促进细胞从G1期过渡到细胞分裂活跃期(S和G2期),加快细胞周期进程;TE还可以促进细胞周期蛋白的表达明显增加。在信号通路方面,TE可以激活HUVECs中PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK以及JNK MAPK通路,而对p38 MAPK和NF-κB通路以及下游信号通路中包括caspase-3,8,9以及Cyto C蛋白表达没有影响;免疫荧光检测结果证实TE确实可以激活PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK以及JNK MAPK通路。信号通路干预结果显示PD98059可以抑制Cyclin B1和Cyclin D1的表达,而LY294002和SP600125对其没有影响,说明TE主要是通过激活ERK1/2 MAPK通路上调细胞周期蛋白表达的。最后,细胞划痕修复试验结果表明,TE可以诱导HUVECs发生细胞迁移。第二部分:Cc GRN-1的生物学活性研究CCK-8法检测结果显示,Cc GRN-1和VEGF均对HUVECs活力具有时间和剂量依赖性促进作用。流式细胞术结果显示,两者均可以促进细胞从G1期过渡到细胞分裂活跃期(S和G2期),加快细胞周期进程;此外,两者还可以促进细胞周期蛋白表达增加。在信号通路激活方面,Western Blotting结果显示Cc GRN-1和VEGF均可以激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路,而对JNK MAPK和NF-κB通路没有影响;免疫荧光检测结果证实了Cc GRN-1和VEGF确实可以激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路。信号通路干预结果显示PD98059可以抑制Cyclin B1和Cyclin D1的表达,而LY294002没有影响,说明Cc GRN-1主要是通过激活ERK1/2 MAPK通路上调细胞周期蛋白表达的。最后,细胞划痕修复试验结果表明,Cc GRN-1和VEGF均可以诱导HUVECs发生细胞迁移。结论低浓度TE可以提高细胞活力,加快细胞周期进程,促进细胞周期蛋白的表达,提示TE具有促细胞增殖效应;在作用机制方面,TE可以磷酸化激活PI3K/Akt,ERK1/2 MAPK和JNK MAPK通路,而其中的ERK1/2 MAPK通路与细胞周期蛋白的表达增加密切相关,提示其可能与促细胞增殖有关;最后,细胞划痕修复实验表明TE可以诱导细胞迁移。另一方面,Cc GRN-1具有与VEGF类似的细胞活力效应,可以加快细胞周期进程,促进细胞周期蛋白的表达,表明Cc GRN-1具有与VEGF类似的促细胞增殖效应;在作用机制方面,Cc GRN-1也与VEGF类似,主要激活PI3K/Akt和ERK1/2 MAPK通路,而其中的ERK1/2 MAPK通路与细胞周期蛋白的表达增加密切相关;最后,通过细胞划痕修复实验表明Cc GRN-1与VEGF均可以诱导细胞迁移。基于Cc GRN-1和VEGF在促进细胞增殖方面具有很大的共性,我们认为Cc GRN-1作为一种海洋生物来源的多肽,对某些特殊疾病或环境造成的伤口难愈合情况可能具有良好的应用前景。
【关键词】：水母 触手提取物 多肽生长因子 血管内皮生长因子 促增殖活性 信号通路
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R915
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 缩略词表 Abbreviations14-16
• 前言16-19
• 第一部分 发形霞水母触手提取物的生物学活性研究19-43
• 一、前言19-21
• 二、材料和方法21-28
• 三、实验结果28-41
• 四、讨论41-43
• 第二部分 发形霞水母来源多肽生长因子的生物学活性研究43-71
• 一、前言43-44
• 二、材料和方法44-52
• 三、实验结果52-69
• 四、讨论69-71
• 全文总结71-72
• 综述72-78
• 参考文献77-78
• 参考文献78-84
• 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明84-87
• 致谢87

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