苯丙氨酸二肽与siRNA共组装转运体的制备及抗肿瘤活性研究

发布时间：2017-10-18 17:14

  本文关键词：苯丙氨酸二肽与siRNA共组装转运体的制备及抗肿瘤活性研究

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【摘要】：RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是指双链RNA(ds RNA)能够高效、特异性地促进同源m RNA降解,从而阻断目标基因表达的现象。这种RNAi机制在生物细胞内普遍存在,并且由于其能够方便、快捷地阻断目标基因的表达,近些年已经成为基因治疗的有效手段之一。其中,利用RNAi技术阻断肿瘤细胞发育过程中的特定信号通路,可高效、便捷地促进肿瘤细胞凋亡,是目前抗肿瘤治疗的热点课题之一。目前,RNAi技术临床应用过程中面临着的瓶颈主要是si RNA的有效递送问题。优秀的si RNA的递送载体应具备以下几个要素:(1)易与si RNA结合,并能保护si RNA不被核糖核酸酶(Ribonuclease,RNase)降解,同时载体与si RNA复合物又不能影响si RNA进入细胞后发挥作用;(2)载体材料转染效率高;(3)对特异组织或特异细胞具有靶向性,可以提高特异组织或细胞的转染率,从而提高特异组织或细胞的RNAi效率;(4)材料毒性低,不易引起机体的免疫反应,生物相容性好,容易在生物体内降解。通过对目前已知的si RNA递送载体比较后我们发现,阳离子多肽载体是目前较为理想的载体材料之一。其具有容易合成,尺寸可调控,结构容易修饰,可修饰靶向配体使其具有靶向定位功能,并且材料性质稳定,细胞毒性低,在生物体内容易被代谢等优点[1]。基于此,本课题考察了苯丙氨酸二肽纳米球(CDPNTs)作为一种新型si RNA载体的应用潜力。我们以卵巢癌细胞(SK-OV-3)为细胞模型,考察了CDPNTs递送survivin基因的si RNA的能力,以及促SK-OV-3细胞的凋亡情况。在本论文中,我们主要考察了CDPNTs载体材料的细胞毒性,与si RNA结合情况,转染情况,对survivin基因m RNA干扰效果,以及对SK-OV-3细胞的促凋亡作用。检测结果表明CDPNTs材料细胞毒性较低,CDPNTs浓度分别为10和100μg/m L时,SK-OV-3细胞48小时存活率分别为88.241±1.739%和83.102±5.428%。而阳性对照组Lipofectamine 2000(5μg/m L)的细胞存活率为80.440±5.842%,由此可见浓度为10-100μg/m L的CDPNTs细胞毒性均低于Lipofectamine 2000;我们通过琼脂糖电泳实验证明,CDPNTs可以与si RNA稳定结合;CDPNTs递送FAM标记的si RNA进入细胞后,荧光显微镜观察到FAM-si RNA集中在细胞质基质中;CDPNTs递送si RNA进入细胞后可以正常发挥RNAi作用,我们用CDPNTs递送了抑制凋亡的survivin基因的si RNA进入SK-OV-3细胞48小时后,细胞中survivin基因m RNA的表达被显著抑制,并且细胞出现明显凋亡。
【关键词】：RNA干扰 siRNA载体 苯丙氨酸二肽自组装纳米球 survivin
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96
【目录】：

• 缩略词语表4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-29
• 1.1 RNAi简介12-14
• 1.2 RNAi应用于肿瘤的治疗14-18
• 1.2.1 肿瘤发生相关基因——survivin15-18
• 1.2.1.1 Survivin简介15-18
• 1.2.1.2.1 survivin基因的调控15-16
• 1.2.1.2.2 Survivin对细胞周期的调控16-17
• 1.2.1.2.3 Survivin对细胞凋亡的调控17-18
• 1.3 siRNA的递送研究进展18-24
• 1.3.1 siRNA化学修饰后直接递送19
• 1.3.2 siRNA的载体递送19-24
• 1.3.2.1 siRNA的病毒载体20-21
• 1.3.2.2 siRNA的非病毒载体21-24
• 1.3.2.2.1 siRNA的阳离子脂质体载体21-22
• 1.3.2.2.2 siRNA的阳离子聚合物载体22-23
• 1.3.2.2.3 siRNA的阳离子多肽载体23-24
• 1.4 苯丙氨酸二肽24-26
• 1.5 选题目的与设计26-29
• 1.5.1 选题目的26-27
• 1.5.2 论文设计27-29
• 第二章 材料与方法29-42
• 2.1 材料与试剂29-31
• 2.1.1 材料列表29-30
• 2.1.2 主要试剂列表30-31
• 2.2 主要仪器和设备列表31-32
• 2.3 实验方法32-42
• 2.3.1 固相肽合成法合成苯丙氨酸二肽32-34
• 2.3.2 苯丙氨酸二肽的自组装34-35
• 2.3.3 苯丙氨酸二肽自组装结构扫描电镜观察35
• 2.3.4 CDPNTs表面电位检测35
• 2.3.5 CDPNTs与siRNA连接的检测35
• 2.3.6 SK-OV-3 细胞系的培养35-36
• 2.3.7 CDPNTs细胞毒性检测36
• 2.3.8 CDPNTs递送siRNA转染细胞检测36
• 2.3.9 survivin基因的siRNA的合成36-37
• 2.3.10 CDPNTs递送FAM-siRNA转染细胞检测37
• 2.3.11 CDPNTs递送survivin siRNA转染SK-OV-3 细胞后survivin mRNA表达量检测37-40
• 2.3.12 CDPNTs递送survivin siRNA转染SK-OV-3 细胞后细胞凋亡检测40-41
• 2.3.13 数据分析41-42
• 第三章 结果与讨论42-57
• 3.1 苯丙氨酸二肽合成与纯化42-43
• 3.2 苯丙氨酸二肽自组装扫描电镜观察43-44
• 3.3 CDPNTs表面电位检测44-45
• 3.4 CDPNTs与siRNA连接的检测45-46
• 3.5 CDPNTs细胞毒性检测46-47
• 3.6 CDPNTs递送siRNA转染细胞检测47-48
• 3.7 CDPNTs递送survivin siRNA转染SK-OV-3 细胞后survivin mRNA表达量检测48-51
• 3.7.1 survivin基因RT-PCR检测48-49
• 3.7.2 survivin基因REAL-TIME PCR检测49-51
• 3.8 CDPNTs递送survivin siRNA转染SK-OV-3 细胞后细胞凋亡检测51-55
• 3.8.1 细胞凋亡的形态学观察51-52
• 3.8.2 CDPNTs递送survivin siRNA转染SK-OV-3 细胞后细胞存活率检测52-53
• 3.8.3 流式细胞仪分析细胞凋亡53-55
• 3.9 讨论55-57
• 第四章 结论57-58
• 参考文献58-69
• 致谢69

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