单核细胞激活试验方法在单克隆抗体药物热原检测中的应用研究

发布时间：2017-10-23 22:15

  本文关键词：单核细胞激活试验方法在单克隆抗体药物热原检测中的应用研究

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【摘要】：本课题针对目前传统热原检测方法的不足,研究单核细胞激活试验方法(Monocyte-Activation Test,MAT)在单克隆抗体药物热原检测中的应用,希望能够更好地评价单克隆抗体药物的安全性。本课题的工作如下:一、建立一种新的单核细胞激活试验。参照欧洲药典(European Pharmacopoeia,EP)、英国药典(British Pharmacopeia,BP)及相关文献对5种单核细胞及相关的细胞因子进行筛选,找到对热原敏感的细胞系及相应的细胞因子,并对该试验的重要参数如接种细胞密度、孵育时间、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)浓度等进行探讨研究。(1)本试验探讨了人白血病THP-1、SJ1细胞、淋巴瘤Raji、WIL2-S细胞和人红白血病K562细胞在内毒素(endotoxin,也称磷酸脂多糖lipopolysaccharide,LPS)、酵母多糖(zysoman)和脂壁酸(lipoteichoic acid,LTA)常见热原的刺激下分泌白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的量,结果表明SJ1细胞在LPS、zysoman、LTA的刺激下分泌的IL-6的量与阴性对照有明显区别,而其他细胞对热原刺激均不敏感,因此,SJ1/IL-6法可能是一种新的单核细胞激活试验方法;(2)探讨了细胞密度对试验结果的影响,结果表明当细胞接种密度在1.0×105个/m L~1.0×107个/m L范围内,LPS、zysoman、LTA刺激SJ1细胞后,细胞分泌IL-6的量随细胞密度的增大而增加,最终确定该试验接种的细胞密度为5.0×106个/m L;(3)探讨不同孵育时间对结果的影响,试验结果表明热原刺激SJ1细胞48小时,细胞分泌IL-6的量最高,最终确定热原孵育时间为48小时;(4)探讨FBS浓度对试验结果的影响,结果表明当FBS浓度在0.5%~20%的范围内,随着FBS浓度的降低,LPS、zysoman、LTA刺激SJ1细胞后,细胞分泌IL-6的量逐渐增加,最终确定用含2%FBS浓度的培养液进行试验。通过以上探讨,首次建立了SJ1/IL-6单核细胞激活试验作为热原检测的补充试验。二、对SJ1细胞进行鉴定。按欧洲药典、中国药典(Chinese Pharmacopoeia,Ch P)中相关章节对细胞系的要求,对SJ1细胞进行细胞形态鉴定、无菌检查、支原体检查、外源病毒污染检查、细胞功能稳定性检查。镜下观察到本实验室SJ1细胞的形态与美国菌种保藏中心(American type culture collection,ATCC)细胞库中细胞形态一致。无菌检查、支原体检查和外源病毒污染检查均按照2015版中国药典相关规定进行检查,结果均为阴性。细胞功能稳定性检查包括测定不同代次细胞生长曲线和不同代次细胞热原敏感性。结果表明各个代次细胞生长曲线基本一致;细胞生长到10代左右对热原刺激最敏感,细胞生长到20代以后,对热原刺激的敏感性逐渐下降。三、对建立的SJ1/IL-6方法进行准确度、重复性、定量限、线性和专属性的验证。测得LPS?zysoman?LTA在流感疫苗、冻干人用狂犬病疫苗、麻腮风联合减毒活疫苗、麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗的回收率均在50%~200%范围内,表明该方法在以上品种热原测定中准确度良好。对A群C群脑膜炎球菌疫苗进行内毒素含量测定,RSD值小于20%(n=6),表明该方法的重复性良好。LPS、zysoman、LTA的检测限分别为0.06EU/m L,0.06μg/m L和0.06μg/m L。用一系列浓度的LPS?zysoman?LTA标准品溶液刺激SJ1细胞后,IL-6的分泌量与不同浓度LPS?zysoman?LTA的线性关系良好,R2均大于0.95。四、将SJ1/IL-6法与传统细菌内毒素检查法(the Bacterial Endotoxins test,BET)进行比较。分别用本实验室建立的SJ1/IL-6方法和中国药典收载的浊度法,测定两个厂家10个批次A群C群脑膜炎疫苗球菌多糖疫苗的内毒素含量,经t-检验分析两种方法测得的10个批次的A群C群脑膜炎疫苗球菌多糖疫苗内毒素含量无显著性差别(P0.05)。五、考察该方法在阿达木单抗注射液热原检测中的应用。对该方法用于阿达木单抗注射液热原检测进行了系统的探讨。(1)测3种热原在阿达木单抗注射液2倍、10倍、20倍、50和100倍稀释液中的回收率,结果表明阿达木单抗注射液稀释倍数大于50倍时,LPS、zysoman、LTA的回收率均在50%~200%范围内,因此阿达木单抗注射液在稀释50倍时适合用该方法进行热原检测;(2)探讨高、中、低3种浓度LPS、zysoman、LTA在阿达木单抗50倍稀释液中的回收率变化情况,结果表明3种浓度LPS、zysoman、LTA在阿达木单抗50倍稀释液中的回收率均在50%~200%范围内,说明该方法用于阿达木单抗注射液热原检测时准确度较好;(3)将稀释50倍的不含内毒素的阿达木注射液加入LPS(LPS终浓度为0.25EU/m L)刺激SJ1细胞,测分泌的IL-6的量,RSD值小于20%(n=6),说明该方法用于阿达木单抗注射液热原检测时重复性较好;(4)用该方法测定5个不同批号阿达木热原含量,结果均为阴性。六、考察该方法在其他单抗样品热原检测中的应用。将该方法应用于注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白、尼妥珠单抗注射液、重组抗CD25人源化单克隆抗体注射,雷珠单抗注射液和贝伐珠单抗注射液的热原检测,测LPS、zysoman、LTA在这5种单抗合适稀释倍数下的的回收率以及这5种单抗热原含量。结果表明,LPS、zysoman、LTA在这5种单抗注射液的回收率均在50%~200%范围内,测得的内毒素含量结果均为阴性。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国医药工业研究总院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R927.1
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-17
• 第1章:绪论17-25
• 1.1 热原检查17-19
• 1.1.1 家兔法17
• 1.1.2 细菌内毒素检查法17-18
• 1.1.3 单核细胞激活试验18-19
• 1.2 单克隆抗体药物19-21
• 1.2.1 单克隆抗体药物生产工艺简介20
• 1.2.2 单克隆抗体药物安全性控制项目20-21
• 1.2.3 单抗药物的热原检查21
• 1.3 本课题立题依据21-22
• 1.3.1 国内热原检测现状21-22
• 1.3.2 国外热原检测现状22
• 1.4 本课题主要研究内容22-25
• 第2章：单核细胞激活试验方法的建立25-37
• 2.1 试剂和仪器25-26
• 2.1.1 试剂和耗材25
• 2.1.2 仪器25-26
• 2.2 试验方法26-28
• 2.2.1 热原标准品溶液的配制26
• 2.2.2 试验用细胞培养26
• 2.2.3 操作方法26-28
• 2.3 试验结果28-35
• 2.3.1 细胞系筛选试验结果28-31
• 2.3.2 细胞密度的探讨结果31-32
• 2.3.3 药物作用时间的探讨结果32-33
• 2.3.4 FBS浓度的探讨结果33-35
• 2.4 本章小结35-37
• 第3章：SJ1细胞的鉴定37-45
• 3.1 试剂与仪器37-38
• 3.1.1 试剂和耗材37
• 3.1.2 仪器37-38
• 3.2 试验方法38-40
• 3.2.1 细胞鉴别38
• 3.2.2 无菌检查38-39
• 3.2.3 支原体检查39
• 3.2.4 外源病毒污染检查39
• 3.2.5 不同代次细胞生长稳定性检查39-40
• 3.2.6 不同代次细胞热原敏感性检查40
• 3.3 试验结果40-43
• 3.3.1 细胞鉴别检查结果40-41
• 3.3.2 无菌检查试验结果41
• 3.3.3 支原体检查试验结果41
• 3.3.4 外源病毒污染检查试验结果41-42
• 3.3.5 不同代次细胞生长稳定性检查结果42
• 3.3.6 不同代次细胞的热原敏感性检查结果42-43
• 3.4 本章小结43-45
• 第4章：方法验证45-57
• 4.1 试剂与仪器45-46
• 4.1.1 试剂和耗材45-46
• 4.1.2 仪器46
• 4.2 试验方法46-49
• 4.2.1 热原标准溶液的配制46-47
• 4.2.2 样品溶液的配制47-48
• 4.2.3 试验用细胞培养48-49
• 4.2.4 细胞铺板49
• 4.2.5 加样及孵育49
• 4.2.6 细胞因子IL-6 的测定49
• 4.3 试验结果49-54
• 4.3.1 准确度49-50
• 4.3.2 重复性50
• 4.3.3 线性50-52
• 4.3.4 定量限52-54
• 4.4 本章小结54-57
• 第5章：SJ1/IL-6 法与细菌内毒素检查法的比较57-61
• 5.1 试剂与仪器57-58
• 5.1.1 试剂和耗材57
• 5.1.2 仪器57-58
• 5.2 试验方法58-59
• 5.2.1 细菌内毒素(LPS)标准品溶液的配制58
• 5.2.2 样品溶液的配制58
• 5.2.3 试验用细胞培养58
• 5.2.4 细胞铺板58-59
• 5.2.5 标准品、样品溶液的加样及孵育59
• 5.2.6 细胞因子IL-6 的测定59
• 5.3 试验结果59-60
• 5.4 本章小结60-61
• 第6章：SJ1/IL-6 法在阿达木单抗样品热原检测中的应用研究61-69
• 6.1 试剂与仪器61-62
• 6.1.1 试剂和耗材61
• 6.1.2 仪器61-62
• 6.2 试验方法62-64
• 6.2.1 热原标准品溶液的配制62
• 6.2.2 样品溶液的配制62-63
• 6.2.3 试验用细胞培养63
• 6.2.4 细胞铺板63
• 6.2.5 标准品、样品溶液的加样及孵育63-64
• 6.2.6 细胞因子IL-6 的测定64
• 6.3 试验结果64-67
• 6.3.1 LPS、zysoman、LTA在不同稀释倍数的阿达木单抗注射液中的回收率64-65
• 6.3.2 不同浓度LPS、zysoman、LTA在稀释50倍的阿达木中的回收率65-66
• 6.3.3 阿达木样品内毒素含量重复6次测定结果66
• 6.3.4 阿达木样品LPS、zysoman、LTA含量的测定结果66-67
• 6.4 本章小结67-69
• 第7章 SJ1/IL-6 法在其他各类单抗样品热原检测中的应用研究69-75
• 7.1 试剂与仪器69-70
• 7.1.1 试剂与耗材69
• 7.1.2 仪器69-70
• 7.2 试验方法70-71
• 7.2.1 样品溶液的配制70-71
• 7.2.2 其他71
• 7.3 试验结果71-73
• 7.3.1 各单抗样品LPS、zysoman、LTA回收率测定结果71-72
• 7.3.2 各单抗样品LPS、zysoman、LTA含量测定结果72-73
• 7.4 本章小结73-75
• 参考文献75-79
• 全文总结79-81
• 创新性分析81-83
• 对进一步研究工作的设想和建议83-84
• 攻读学位期间发表的学术论文、专利申请84-85
• 致谢85

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