β2受体激动剂沙美特罗对NLRP3炎症小体介导的全身性炎症的调节及机制

发布时间：2017-11-12 12:12

  本文关键词：β2受体激动剂沙美特罗对NLRP3炎症小体介导的全身性炎症的调节及机制

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【摘要】：炎症(Inflammation)是十分常见而又相当重要的病理过程,它可以发生于机体内各部位的组织和器官。传统意义的炎症指具有血管系统的活体组织对损伤因子的防御性反应,体表的外伤感染和各器官的大部分常见病都属于炎症性疾病,例如毛囊炎、扁桃体炎、肺炎、肾炎、肝炎等等。炎症的本质是防御,以变质、渗出和增生为基本病理变化,临床主要表现为红、肿、热、痛等。近年来,原本被认为与炎症无关的多种疾病,如多发性硬化、阿尔兹海默症、帕金森病、II型糖尿病等,均有研究报道其发病机制与炎症有关,因此,对机体的炎症反应进行调控已经成为当今刻不容缓的研究重点。NLRP3炎症小体是NLRs炎症小体家族的一员,也是目前研究最广泛的NLR家族成员,主要表达于外周单核巨噬细胞。近年来,人们逐渐发现炎症小体在各类炎症性疾病中发挥了重要作用,炎症小体也逐渐成为各类炎症发病机制中的研究热点。巨噬细胞是机体免疫系统的重要呈递细胞,其在特异性和非特异性免疫中均发挥重要作用,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞是一种组织内的白细胞,是由骨髓中的干细胞分化而来。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。近年来,巨噬细胞在全身性炎症反应与NLRP3炎症小体中的作用逐渐受到重视。肾上腺素受体是介导儿茶酚胺作用的一类组织受体,为G-蛋白耦联受体(Gprotein coupled receptors, GPCR)。根据其对去甲肾上腺素的不同反应情况,分为肾上腺素能a受体和p受体。其中,β2肾上腺素受体是一种GPCR受体,能够调控许多生理功能,例如呼吸道平滑肌、血管平滑肌的活动等。p2受体已被证明在包括巨噬细胞、小胶质细胞、T细胞及B细胞等免疫细胞上表达,并且刺激β2受体能够影响这些细胞的炎症反应。研究表明短效和长效β2受体激动剂均能够调节免疫细胞的炎症反应。然而,β2受体激动剂在外周中对全身性炎症的作用目前未见研究。沙美特罗是一种β2受体激动剂,通过其对呼吸道平滑肌的作用,已被广泛应用于哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)的抗炎治疗,但目前仍缺乏沙美特罗对全身性炎症反应的研究。因此,本研究提取C57BL/6J小鼠的原代骨髓源性巨噬细胞,制备细胞炎症模型,研究β2受体激动剂沙美特罗是否能够通过NLRP3炎症小体在发挥抗炎作用及其作用机制。结合LPS制备C57BL/6J小鼠全身性炎症模研究、阐明沙美特罗在全身性炎症中所发挥的抗炎作用及其机制,揭示沙美特罗的新颖药理作用,并为未来全身性炎症的治疗提供新思路。目的：研究β2受体激动剂对NLRP3炎症小体介导的炎症的调节及机制。方法：1.应用原代骨髓源性巨噬细胞,给予LPS+ATP刺激建立细胞炎症模型,同时给予10-12M～10-7M等不同浓度的沙美特罗,阐明沙美特罗发挥抗炎作用的有效浓度。2.应用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)以及酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上述细胞中NLRP3炎症小体各组分的蛋白表达水平(NLRP3、 caspase-1、IL-1β),研究沙美特罗对NLRP3炎症小体活性的影响。3.应用原代骨髓源性巨噬细胞上,给予LPS+ATP、poly(dA:dT)、MDP、Flagellin等刺激,激活多种不同的炎症小体,给予上述有效浓度的沙美特罗,阐明沙美特罗对NLRP3炎症小体作用的特异性。4.应用cAMP检测试剂盒对原代骨髓源性巨噬细胞中的cAMP表达水平进行检测,评价沙美特罗的抗炎作用是否依赖cAMP信号通路。5.应用Western Blot方法检测β-arrestin1、β-arrestin2的蛋白表达水平。在骨髓源性巨噬细胞中干扰β-arrestin1、2的表达后评价沙美特罗的抗炎作用是否被取消。应用免疫共沉淀(Co-IP)方法,观察沙美特罗对NLRP3炎症小体与β-arrestin2结合的影响。结果：1.在原代BMDM细胞上,10-10M-10-7M浓度的沙美特罗有抗炎作用,并且其抗炎作用被KH7取消,被H89部分取消。2.沙美特罗主要通过NLRP3炎症小体发挥抗炎作。3.在原代BMDM上干扰β-arrestinl的表达后抑制NLRP3炎症小体的激活。10-10M浓度的沙美特罗能升高cAMP的表达,呈剂量依赖性。4.沙美特罗能够逆转LPS+ATP所引起的β-arrestin2下调,干扰β-arrestin2后,沙美特罗的抗炎作用被抑制。10-10M浓度的沙美特罗能促进β-arrestin2与NLRP3的相互作用。结论：1.沙美特罗能够通过调控NLRP3炎症小体发挥抗炎作用。2.临床浓度的沙美特罗主要通过经典GPCR-cAMP通路发挥抗炎作用,而极低浓度的沙美特罗则通过非经典β-arrestin2通路发挥抗炎作用。综上所述,本文的主要创新之处在于：1.揭示β2受体激动剂沙美特罗在全身性炎症中的抗炎作用。研究发现沙美特罗能够显著抑制LPS+ATP所诱导的细胞炎症反应,并在LPS所致的炎症模型小鼠上验证了极低浓度沙美特罗的抗炎作用,为将沙美特罗等β2肾上腺素受体激动剂发展为抗炎药物积累学术基础。2.发现不同浓度的沙美特罗通过不同的信号通路发挥抗炎作用。研究发现10-7M浓度的沙美特罗主要通过经典的GPCR-G蛋白-第二信使通路发挥抗炎作用,而10-0M浓度的沙美特罗主要通过非经典的GPCR-β-arrestin2信号通路发挥抗炎作用。该结果为深入研究p2肾上腺素受体乃至GPCR的偏向激活的原理提供实验基础。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

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1 ;188沙美特罗在慢性阻塞型肺疾病治疗作用中的评价[J];国外医学(内科学分册);1998年07期

2 朱淑玉;新药沙美特罗[J];哈尔滨医科大学学报;1999年03期

3 蒋翠莺;孙文R，

本文编号：1175847