融合肽hEGF-AWRK6的毒性研究

发布时间：2017-11-14 12:34

  本文关键词：融合肽hEGF-AWRK6的毒性研究

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【摘要】：融合肽hEGF-AWRK6是利用大肠杆菌表达系统,通过IPTG诱导,表达纯化得到的人表皮生长因子(hEGF)和抗菌肽AWRK6的重组融合肽。实验室前期研究结果证明融合肽hEGF-AWRK6是具有抗菌活性和促伤口愈合活性的双功能多肽,有望开发成为治疗烧伤和创伤等病症的临床药物。一种药物的开发研究,前期必须要进行急性毒性研究,一般的方法是采用小鼠经口或者注射药物进行急毒测试。现如今利用动物进行急性毒性试验,因涉及到伦理问题而备受争议,再加上动物使用3R原则的提出,发展细胞毒性和模式生物毒性预筛模型来预测动物急性毒性,成为毒性研究领域的热点研究方向。为了进一步临床应用,本实验研究了融合肽hEGF-AWRK6对正常细胞、模式生物和啮齿类动物的毒性作用。本文首先进行细胞体外毒性测试和秀丽隐杆线虫毒性测试,然后根据测试结果,估算小鼠体内急性毒性测试的用药剂量,以此达到减少实验动物使用量、精确毒性测试结果和探究体外替代毒理研究方法目的。实验方法：本实验首先进行细胞毒性检测,所选用的细胞有小鼠成纤维细胞(3T3)和人角质形成细胞(HACAT)。利用CCK8方法测定5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、50mg/mL融合肽hEGF-AWRK6对细胞活性的影响。在细胞毒性测试的基础上,以相同浓度梯度的融合肽hEGF-AWRK6作用于秀丽隐杆线虫进行毒性测试,测量指标包括秀丽隐杆线虫的半致死率、生殖能力、运动能力和最长寿命等。根据细胞和秀丽隐杆线虫毒性测试结果,设定小鼠腹腔注射毒性试验的抗菌肽用量,分别以40mg/kg、200mg/kg、1000mg/kg、2500mg/kg、5000mg/kg的hEGF-AWRK6对小鼠进行腹腔注射,测量指标包括小鼠半死率、脏器指数、精子畸形率和血生化指标等。实验结果：细胞毒性检测的结果显示，,融合肽hEGF-AWRK6对正常细胞毒性较低,IC5050mg/mL。在秀丽隐杆线虫毒性实验中,融合肽hEGF-AWRK6的MTC=50mg/mL,LC50=22.01mg/mL,其95%置信区间为19.18-25.76,对秀丽隐杆线虫的生殖能力、运动能力和最长寿命无显著影响。小鼠急性毒性试验中,融合肽hEGF-AWRK6的MTD5000mg/kg BW,LD505000mg/kg BW,根据急毒分级标准,hEGF-AWRK6属无毒级,且对小鼠的脏器指数、精子畸形率、血生化指标等无显著影响。结论：融合肽hEGF-AWRK6无实际毒性,通过对细胞毒性、秀丽隐杆线虫毒性试验结果进行分析,发现秀丽隐杆线虫毒性研究模型是替代传统啮齿类毒性研究的可行性方法。
【学位授予单位】：辽宁大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R965

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本文编号：1185441