细胞外酸中毒对原代培养皮层神经元NLRP1炎症小体激活的影响及其机制研究

发布时间：2017-12-04 08:02

  本文关键词：细胞外酸中毒对原代培养皮层神经元NLRP1炎症小体激活的影响及其机制研究

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【摘要】：炎症小体(inflammasome)是由胞浆内模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)参与组装的多蛋白复合物,是宿主固有免疫系统的重要组成部分。NLRP1炎症小体(NAcht leucinerich-repeat protein-1,NLRP-1)是最早被鉴定的炎症小体,包括NLRP1、caspase-1以及炎症小体相关的接头蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC),它在神经元有表达,参与了多种神经系统疾病的病理生理过程。酸中毒(acidosis)是由于酸碱平衡失调导致过度的酸在体液积聚的一种病理状态,是多种神经系统疾病共有的特征。但是目前酸中毒与NLRP1炎症小体之间的关系尚不明确。目的:研究细胞外酸中毒对原代培养皮层神经元NLRP-1炎症小体激活的影响及机制,探讨NLRP-1炎症小体在酸中毒诱导神经元损伤中的作用。方法:采用western blot方法检测细胞外酸化处理组及药物处理组原代培养皮层神经元NLRP-1、caspase-1、ASC、IL-18、IL-1β、Bax、Bcl2、Caspase-3的表达情况;全细胞膜片钳方法观察细胞外酸化对皮层神经元大电导钙激活钾通道(large conductance calcium activated potassium channel,BK)电流的影响;免疫荧光双标法观察皮层神经元酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)和BK通道的共表达情况;采用离子电极选择法检测细胞外酸化处理组及药物处理组原代培养皮层神经元细胞内钾离子浓度;皮层神经元细胞存活率和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放通过MTT法和LDH试剂盒来检测。结果:1.细胞外酸化处理各组(p H 7.0,p H 6.5,p H 6.0)caspase-1、NLRP-1、IL-18、IL-1β、ASC表达均高于正常组(p H7.4),表明细胞外酸中毒可以激活NLRP-1炎症小体。2.细胞外酸化p H 6.5)可以增加皮层神经元BK通道电流,降低细胞内钾离子浓度,BK通道阻断剂Ib TX可抑制这一效应。3.ASICs和BK通道在皮层神经元共表达,ASICs抑制剂amiloride和ASIC1a特异性抑制剂Pc TX1可阻断细胞外酸化诱导的BK电流增加及细胞内钾离子浓度降低。4.BK通道抑制剂Ib TX抑制细胞外酸化(p H 6.5)诱导的caspase-1、NLRP-1、IL-18、IL-1β、ASC表达水平的增高,提示BK通道参与了细胞外酸中毒诱导的NLRP1炎症小体的激活。5.ASIC1a特异性抑制剂Pc TX1抑制细胞外酸化(p H 6.5)诱导的caspase-1、NLRP-1、IL-18、IL-1β、ASC表达水平的增高,提示ASICs参与了细胞外酸中毒诱导的NLRP1炎症小体的激活。6.细胞外酸化(p H 6.5)处理明显降低皮层神经元存活率,促进LDH释放,增加caspase-3和Bax的表达,而减少Bcl2的表达,细胞凋亡明显增多;给予NLRP1Ab(1:100)处理抑制NLRP1炎症小体激活后,细胞外酸化诱导的这些效应明显被抑制,表明NLRP1炎症小体参与了酸中毒诱导的皮层神经元损伤。结论ASICs-BK通道介导了细胞外酸中毒诱导的NLRP1炎症小体的激活,参与了酸中毒诱导的皮层神经元损伤。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
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本文编号：1250276