蓖麻毒素诱导小鼠肺损伤修复及致炎机制初步研究

发布时间：2017-12-18 22:15

  本文关键词：蓖麻毒素诱导小鼠肺损伤修复及致炎机制初步研究

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【摘要】：蓖麻毒素(Ricin Toxin,RT)是蓖麻籽中提取的毒蛋白,是由A链和B链通过二硫键连接形成的分子量约为65kDa的二聚体毒素,是Ⅱ型核糖体失活蛋白。RT的毒性作用具有明显剂量依赖性,高剂量RT主要表现为抑制蛋白质合成的毒性,而在低剂量范围内RT表现为诱导细胞因子的产生、诱导细胞凋亡等。不同接触途径,如摄入、肌内注射或吸入后可产生不同的毒性作用。吸入产生的毒性作用相对于其他途径是最强的,可造成严重的肺损伤,引起压迫性的弥漫性肺泡水肿,由大量活化的巨噬细胞引起急性肺泡炎,伴随着肺间质严重的毛细血管充血和渗透。RT一旦进入肺部,能与各种类型的细胞结合。一旦结合,核糖体活性被抑制,随后细胞快速凋亡。RT通过B链结合半乳糖残基进入细胞内,此半乳糖残基存在于大多数细胞的表面。巨噬细胞上的甘露糖受体,具有结合甘露糖或岩藻糖基糖蛋白的能力。RT既可结合残留的半乳糖残基,又可结合巨噬细胞上的甘露糖受体。巨噬细胞既参与先天免疫又参与适应性免疫,具有吞噬异物的功能。天然免疫是机体抵抗病原微生物的第一道防线,细胞通过其表面或细胞质中的模式识别受体来识别入侵的病原微生物。TLR4是常见的研究较多的模式识别受体,是Toll样受体家族的重要成员,参与天然免疫。组织细胞损伤后,释放炎性介质,与TLR4结合后,启动相关的信号通路,促进炎性因子的释放。TLR4信号通路分为MyD88依赖途径与TRIF依赖途径。目前针对RT的研究,集中于采用超致死剂量与亚致死剂量的RT暴露损伤后,观察机体的炎症反应及相应的组织病理变化,针对低剂量RT引起损伤的研究报道较少。本研究包括以下两个部分内容:(1)RT诱导小鼠肺损伤修复的研究采用改良寇氏法测得小鼠雾化吸入RT的LD50约为4.95±0.14μg/kg。暴露浓度约为1/30 LD50(约164ng/kg)时,组织病理学观察发现,12小时肺组织出现明显的病理变化,正常的肺泡结构破坏,支气管周发生水肿,平滑肌增厚。24小时、第2天损伤加剧。第3、4天损伤最为严重。第5、6天后损伤程度较之前小,血管周围的水肿部分消除。支气管周围水肿消失,第7天与空白组相比,肺泡结构仍未恢复到正常状态。免疫组织化学方法检测肺组织MMP-2、MMP-9蛋白的表达,结果显示,正常组织MMP-2、MMP-9的表达呈弱阳性。吸入RT后,12小时肺组织MMP-2、MMP-9的表达均略微增加。24小时、第2天损伤加剧。与空白组及实验组相比第3天的MMP-2的表达最高,第4天实验组的MMP-9表达最高。第5、6天表达降低,第7天呈弱阳性,基本恢复至正常水平。总之,随着肺组织损伤加重,MMP-2、MMP-9蛋白的表达增加,当组织损伤逐渐修复时MMP-2、MMP-9蛋白的表达也逐渐下降,基本恢复至正常水平。说明此剂量的肺损伤,在一定时间内可自我修复。(2)小鼠肺损伤的致炎机制初步研究用于实验研究的肺泡巨噬细胞不仅需要保证纯度,同时也需要确保其活性。采用支气管肺泡灌洗法分离得到的小鼠肺泡巨噬细胞呈圆形,大小不等,培养2~3小时后大部分细胞完全贴壁生长,培养1~2天后细胞开始变形。采用瑞氏-姬姆萨染色法与Diff-Quik染色法鉴定肺泡巨噬细胞的纯度,结果显示:前者背景杂质较多,可见许多沉积的染色杂质,且染色时间较长;后者染色结果清晰,背景干净无杂质,染色时间短。说明Diff-Quik染色法可以代替瑞氏-姬姆萨染色法,成为一种简捷高效的鉴定肺泡巨噬细胞纯度的方法。FITC标记细菌与肺泡巨噬细胞共培养的方法鉴定细胞活性,结果显示:肺泡巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数随着FITC标记细菌与肺泡巨噬细胞比例的增加而增大,在给定的比例范围内,细菌与细胞比例为20:1时吞噬率和吞噬指数达到最大,随着孵育时间的延长,吞噬率和吞噬指数呈先升高再降低的趋势。小鼠吸入1/150 LD50(约33ng/kg)浓度的RT后,Elisa方法检测3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、60小时、72小时,这几个时间点的肺泡灌洗液上清炎症因子的含量变化,结果显示TNF-α、IL-1β表达呈现一个先增加后降低的趋势,在12小时时表达量最高,相比于空白组差异显著(0.01p0.05)。而IL-6的表达也是呈先增加后降低的趋势,表达量在48小时最高。灌洗液上清总蛋白的表达也是呈现先增加后减少的趋势,总蛋白浓度在60小时最高。同时在3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、60小时、72小时提取肺泡巨噬细胞,半定量RT-PCR方法检测肺泡巨噬细胞上TLR4及其信号转导通路下游相关因子mRNA表达情况。结果显示TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK-1、IRAK-4的表达量在12小时高于其他时间点,并且呈一个先增加后下降的趋势;而TRIF、TRAM的表达量在各时间点无明显差异(p0.05)。说明RT引起TLR4信号通路的反应主要通过MyD88途径起作用的。这与前期本课题组研究的RT体外刺激Raw264.7细胞,引起TLR4及其信号通路相关蛋白表达增加的结果一致。本研究结论:小鼠吸入1/30 LD50剂量RT引起的肺损伤,通过检测MMP-2和MMP-9蛋白表达发现,肺组织可在7天内出现自我修复;小鼠吸入1/150 LD50剂量RT,72小时内可刺激肺泡巨噬细胞TLR4及其信号转导通路下游MyD88、TRAF6、IRAK-1、IRAK-4等相关因子mRNA的表达,引起肺部炎症反应。本研究为进一步阐明RT诱导炎性损伤及修复机制奠定了研究基础。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R996.2

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