一种改良的5-羟色胺转运体活性化合物高内涵筛选方法

发布时间：2017-12-20 01:14

  本文关键词：一种改良的5-羟色胺转运体活性化合物高内涵筛选方法　出处：《天津中医药大学学报》2016年03期 　论文类型：期刊论文

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【摘要】：[目的]建立一种改良的5-羟色胺转运体(SERT)活性化合物高内涵筛选(HCS)方法,包括构建稳定转染h SERT细胞株和优化SERT活性化合物HCS条件。[方法]应用聚乙烯亚胺(PEI)将质粒h SERT-pc DNA3转染入HEK293细胞,采用遗传霉素(G418)筛选获得稳定转染细胞系,以实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting)方法分别从转录和翻译水平验证h SERT表达,采用SERT荧光底物4-(4-二甲氨基)苯基-1-甲基吡啶(APP+)在高内涵系统上验证SERT摄取功能并优化其检测条件,应用选择性SERT抑制剂Fluoxetine和SERT增强剂Tianeptine验证SERT HCS方法可靠性。[结果]经PEI转染和G418筛选获得了稳定转染h SERT-HEK293细胞株。与HEK293细胞相比,h SERT-HEK293细胞中h SERT m RNA和蛋白表达量均显著性增加,APP+摄取实验表明h SERT-HEK293细胞摄取APP+显著性增加,并可被Fluoxetine特异性抑制。实验优化了高内涵检测APP+摄取实验中APP+浓度、孵育时间、数据分析方法等条件。Fluoxetine显著地抑制h SERT-HEK293对APP+的摄取,Tianeptine显著地增强h SERT-HEK293对APP+的摄取,证实此HCS方法的可靠性。[结论]本研究首次优化了应用APP+检测SERT活性的HCS条件,显著提高了SERT荧光检测方法灵敏度,并首次证实此HCS方法适用于SERT促进剂筛选,因此,建立了一种改良的SERT活性化合物HCS方法。
【作者单位】： 天津中医药大学天津市现代中药重点实验室;天津国际生物医药联合研究院中药新药研发中心;
【基金】：国家“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09304007) 国家自然科学基金青年基金(81403132) 天津市高等学校科技发展基金计划项目(20140203) 天津市应用基础及前沿技术研究计划项目(12JCYBJC32400)
【分类号】：R94
【正文快照】： 中药新药研发中心,天津300457)5-羟色胺(5-HT)是一种高度保守的信号传导分子,化学性质属于吲哚胺,主要存在于大脑和消化道中,在运动、睡眠、摄食、生殖、认知以及情感等生理功能调节中发挥重要作用[1]。在生理条件下,5-HT发挥作用后需要及时清除或灭活,以免产生中毒反应及5-HT

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1 李雅婷;郑宜;潘德林;徐波;武芸;杨振军;张礼和;;高内涵筛选用于评价新型siRNA运载试剂的细胞群体生物学活性(英文)[J];Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences;2013年06期

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本文编号：1310189