CXCR4拮抗多肽抗肿瘤功效及纳米银毒理研究

发布时间：2018-01-29 21:06

  本文关键词： CXCR4/CXXL12生物轴 CXCR4拮抗剂E5 乳腺癌 白血病 血管生成 联合用药 纳米银 血管周炎症 活性氧 细胞间连接 银离子　出处：《北京协和医学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：乳腺癌细胞和急性髓系白血病(AML)细胞表面通常较高表达趋化因子受体CXCR4,而其配体CXCL12主要由肿瘤微环境和骨髓中的基质细胞或成纤维细胞分泌。CXCL12能激活CXCR4信号传导通路,为肿瘤细胞提供存活、增殖、粘附和趋化等信号,从而促进肿瘤生长和肿瘤细胞向其他器官的浸润。CXCR4/CXCL12生物轴还可招募白血病细胞向骨髓归巢,与骨髓中的基质细胞粘附,获得生存信号并形成微小残留病灶。上述过程为乳腺癌发生转移或白血病的复发与耐药埋下了隐患。此外,CXCL12还能吸引内皮祖细胞向肿瘤微环境的转移,促进血管生成,为肿瘤的生长提供营养物质。因此阻断CXCR4/CXCL12的相互作用可以抑制肿瘤细胞生长、粘附和浸润行为,从而有效提高化疗药对肿瘤细胞的治疗功效。在前期研究过程中,我们根据CXCR4结构和序列的特征设计得到了小分子多肽E5,并在细胞和动物模型上证明了E5能有效抑制AML细胞对CXCL12活化作用的响应。本研究拟在细胞和乳腺癌小鼠模型及AML小鼠模型上,将E5与化疗药联合使用,评价E5对化疗药治疗功效的作用并研究其作用机理：同时,在健康小鼠模型上研究E5的药代动力学。方法：以小鼠乳腺癌细胞4T1、小鼠骨髓基质细胞MS-5和人脐静脉内皮细胞HUVEC为模型,通过流式细胞术检测E5与乳腺癌细胞的结合情况；利用细胞活性检测试剂(CCK-8)、western blot和Annexin V-PI双染方法检测E5对4T1细胞的毒性；通过transwell细胞迁移小室以及细胞共培养的方法研究E5对细胞向基质细胞迁移和粘附的影响；用western blot方法检测E5对CXCR4下游Akt和Erk信号通路的作用；利用CCK-8方法检测E5联合多种化疗药对于MS-5细胞共培养的4T1细胞活性的影响；在乳腺癌小鼠模型上,将E5与多种化疗药联合应用,对荷瘤小鼠进行治疗,通过监测小鼠肿瘤尺寸和统计小鼠生存期来评价治疗效果。进一步通过用western blot检测小鼠肿瘤内与CXCR4下游信号通路相关的蛋白以及与血管生成相关蛋白的水平,探讨E5的作用机理；在AML小鼠模型上,分别在注射E5前后收集小鼠外周血并用流式细胞术检测E5对AML细胞的动员作用。将E5与长春新碱或环磷酰胺联合治疗,通过检测小鼠体重和生存期以及骨髓、脾脏中白血病细胞比例评价治疗效果；对健康小鼠皮下注射FITC标记的E5,通过荧光成像和检测小鼠血液中的荧光强度来评价E5在体内的代谢。结果：(1)E5与高表达CXCR4的4T1和HUVEC细胞均有较强的结合,而与低表达CXCR4的MS-5细胞结合较弱。(2)当浓度高于25 μM时,E5能抑制4T1细胞的活性,并诱导细胞的凋亡。(3)培养基中添加的CXCL12可以诱导4T1和HUVEC细胞的迁移；而使用E5对两种细胞进行处理,则可有效抑制CXCL12诱导的细胞迁移；此外,E5还能有效抑制由MS-5细胞制备的条件培养基所诱导的4T1细胞的迁移和粘附。(4)E5能有效拮抗CXCR4/CXCL12生物轴介导的信号通路,抑制CXCR4下游Akt和Erk蛋白的磷酸化。(5)当E5分别与紫杉醇、顺铂、阿霉素、或长春新碱联合作用于4T1细胞时,E5能提高细胞对化疗药的敏感性,有效增加化疗药诱导的4T1细胞的死亡。(6)将E5与环磷酰胺或阿霉素联合治疗乳腺癌小鼠时,与单纯化疗药治疗相比,E5联合化疗药能明显抑制乳腺癌小鼠的肿瘤生长,延长荷瘤小鼠的生存期,从而提高化疗药对荷瘤小鼠的治疗效果。(7)E5能明显降低小鼠肿瘤部位CD31的表达水平,抑制肿瘤内新生血管的生成,同时E5有效抑制肿瘤微环境诱导的CXCR4下游Akt和Erk蛋白的磷酸化。(8)E5能有效动员白血病小鼠体内白血病细胞至外周循环中,减缓白血病小鼠的症状。(9)E5联合长春新碱或环磷酰胺显著减少了白血病细胞向骨髓、脾脏和脾脏中的浸润,延长了AML小鼠的生存期。(10)单次皮下注射的E5主要通过小鼠肝脏代谢出体外,在注射后2 h达到最高药物浓度,半衰期约为10 h。结论：E5通过拮抗CXCR4/CXCL12生物轴而阻断乳腺癌细胞、AML细胞与基质细胞的相互作用,有效抑制了乳腺癌细胞和AML细胞趋向CXCL12的迁移和粘附,从而提高了多种化疗药对乳腺癌小鼠和AML小鼠的治疗效果。此外,E5还能通过阻断血管内皮细胞向肿瘤组织中的迁移而抑制血管的生成。因此,E5在调节肿瘤微环境以及乳腺癌和AML的治疗中具有应用价值。目的：纳米银(AgNPs)具有显著优于银离子化合物的抗菌性能,因此在家用产品、电子、食品包装、医用器械等领域都有广泛的应用探索。但是,随着日常生活和医疗中接触含AgNPs材料机会的增加,AgNPs对健康、环境和安全的影响正在引起各国政府和国际组织机构以及学术界的密切关注。大量研究已经表明,AgNPs对不同种类的细胞均有明确的细胞毒性和遗传毒性,主要表现在抑制细胞生长、增加细胞膜通透性、诱导胞内氧化应激反应,影响炎症因子和细胞因子的分泌、改变细胞间连接、损伤DNA等。AgNPs可以通过不同途径进入生物体,且主要集中在模型动物的肝、肺、肾、脾等靶器官中,与此同时,AgNPs可以在复杂的生物环境中持续释放Ag+。但是,目前对于两者介导的毒性作用机制和贡献比例迄今仍不清楚。静脉暴露AgNPs可以模拟医疗人员或病人伤口接触含AgNPs医疗器械时经血液途径暴露的过程。本研究采用尾静脉注射暴露方式研究比较AgNPs和硝酸银(AgNO3)的全身毒性,并探讨两者细胞毒性机制的差异。方法：选择柠檬酸包被的不同尺寸的AgNPs(10、75和110 nm)和AgNO3为研究材料,在人脐静脉血管内皮细胞株(HUVEC)上,通过透射电镜(TEM)观察和动态光散射(DLS)检测,研究AgNPs在不同介质中的分散稳定性、颗粒尺寸分布以及表面电荷状态；采用CCK-8法研究AgNPs对细胞增殖的影响,采用Hoechst/PI染色方法检测AgNPs对细胞凋亡的影响；采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测细胞对AgNPs或AgNO3的摄取,并通过TEM观察AgNPs在细胞中的定位；利用流式细胞术分析AgNPs对细胞内ROS水平的影响；并利用激光共聚焦显微观察细胞连接蛋白的变化和细胞骨架微丝蛋白的重排。在体内实验中,经尾静脉单次或多次注射AgNPs至小鼠体内后,通过TEM观察AgNPs在小鼠肝脏中的定位；通过组织切片观察小鼠各组织器官及其血管周围的病理改变,以及检测血清中肝、肾功的主要血生化指标和补体C3的变化,以探究AgNPs对小鼠的器官毒性。结果：(1)三种尺寸的AgNPs都呈颗粒状,大小均匀,平均尺寸分别为11 ±1 nm、 76 ±6 nm和107±8nm；表面带负电荷,在水中的水合粒径分别为9.8±3.2nm、 72.0 ± 0.9 nm和99.3±1.7 nm,能分散于水和含血清培养基中。(2)AgNPs可以通过内吞途径进入HUVEC细胞内,并定位在囊泡或自噬体中；而AgNO3进入细胞的量很少。 (3)AgNPs能明显抑制细胞的增殖,且具有明显的浓度依赖效应,在20μg/mL浓度下,细胞的抑制率分别为6.7%、12.8%和47.3%,而AgNO3在该浓度下,细胞存活率为1.2%。(4)三种尺寸的AgNPs都能明显引起HUVEC细胞内产生大量的活性氧(ROS),且具有明显的浓度依赖性;此外AgNPs减少了HUVEC细胞间钙黏蛋白的作用并介导了细胞骨架的重排,由此破坏了血管内皮细胞间连接；抗氧化剂乙酰半胱氨酸(NAC)能明显抑制AgNPs诱导的细胞内ROS水平的升高和降低AgNPs对细胞间钙黏蛋白的影响,提高细胞的生存率；低剂量的AgNO3没有引起胞内ROS水平的升高和细胞间连接的变化,而高浓度的AgNO3直接导致了细胞死亡。(5)尾静脉注射的AgNPs主要定位在小鼠肝脏组织中的血管周围；多次尾静脉注射AgNPs能引起小鼠肝、肾、肺等靶器官血管周围明显的炎症反应,包括大量的单核细胞和少量的中性粒细胞在组织血管周围的聚集,显著降低补体C3的水平,引起补体系统的激活；AgNPs引起的肝脏炎症程度达到中等级别；而静脉注射的AgNO3对小鼠的肝、肾、肺影响较小,没有引起明显的病理改变。结论：AgNPs经静脉血液暴露途径进入健康小鼠体内后,可通过内吞方式进入血管内皮细胞,诱导细胞内产生ROS,由此破坏细胞间连接,导致血管内皮泄露并招募炎症细胞向破损的血管组织周围聚集,从而介导小鼠肝、肾、肺等靶器官血管周炎症反应；而AgNO3进入的细胞的量很少,通过非ROS途径介导细胞的坏死。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96
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本文编号：1474361