美洲大赤鱿来源新型硫酸软骨素的制备及抗肿瘤转移活性研究

发布时间：2018-01-30 09:00

本文关键词： 美洲大赤鱿 CS 寡糖抗肿瘤活性　出处：《山东大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：癌症是导致全球人口死亡率升高的一个重要原因。癌症之所以是人类久攻不下的难题与其自身的特性有很大的关系,其中最为棘手的特性是癌细胞能不断迁移并侵入正常组织形成新的病灶。研究发现,在这一过程中肿瘤细胞与相应的正常组织在硫酸软骨素(CS)的含量、组成、分子大小等方面有明显差异。通常,这种CS组成和结构上的差异与肿瘤的发生发展密切相关。这一特性使得CS的抗肿瘤活性成为国内外研究的热点之一。已有研究表明,CS分子的硫酸化模式、分子量大小等决定了CS的抗肿瘤活性。其中,CS-E硫酸化程度高、硫酸化模式复杂,且抗肿瘤活性强、抑瘤谱广,成药价值高。但是,目前商品化的CS-E主要来自一种名为太平洋褶皱鱼(Todarodes Pacificus)的野生小型鱿鱼,价格昂贵,无法大规模生产。随着海洋污染加剧,这类CS-E的原料来源受到更加严重的威胁。更为重要的是,关于CS-E寡糖的抗肿瘤研究较少。本课题通过优选CS原料,建立CS的分离、纯化工艺,制备得到高纯度富含[GlcAβ1-3GalNAc(4S,6S)] (E-unit)的新型CS,分析了其理化性质。同时,优化了CS寡糖制备工艺,分离纯化出富含E-unit的CS寡糖。此外,在分子和动物个体水平系统分析了这一新型CS及其寡糖的抗肿瘤活性,探讨了相关机理。具体如下：1.新型富含E-unit硫酸软骨素(Novel E-unit-rich CS, NER-CS)多糖的制备与纯度分析：以美洲大赤鱿(Dosidicus Gigas)在食品加工过程中的软骨废弃物为原料,建立包括粉碎、脱水脱脂、酶解、除蛋白、醇沉、离子交换、脱盐等操作流程的CS制备方法,制备得到新型CS。最终产品的产率达到16±2%。用商品化的硫酸软骨素ABC酶、硫酸皮肤素酶、透明质酸酶(来自于Streptomyces Hyalurolyticus)、以及实验室自有产权的rHCLase降解所得多糖,根据酶的底物专一性,确认所制备的多糖为CS；通过咔唑反应检测样品中新型CS含量,BCA蛋白定量法检测样品中蛋白含量。结果提示：样品中新型CS含量达到97%以上,蛋白含量低于2%。2.新型CS多糖结构的初步分析：参照葡聚糖分子量标准物,经凝胶过滤HPLC分析,确定所制备的NER-CS多糖平均分子量约为623.2 kDa。再通过硫酸软骨素ABC酶完全降解,结合HPLC分析二糖组成,发现NER-CS主要含有[GlcAβ1-3GalNAc] [GlcAβ1-3GalNAc(4S)]、 [GlcAβ1-3GalNAc(6S)]、 E-unit,其中E-unit含量最高可达44.5%,同时[GlcAp 1-3GalNAc]、 [GlcAβ1-3GalNAc(4S)]、 [GlcAβ1-3GalNAc(6S)]含量分别为7.1%、12.6%、35.8%,总硫酸化度为1.37。是一种新型高硫酸化CS。3NER-CS生物活性的初步分析：1)用Aglyco试剂盒检测NER-CS的抗凝血活性,结果显示：NER-CS抗FⅡa和抗FXa活性分别为20±2 U/mg和0.9±0.2 U/mg,是阳性对照肝素抗FⅡa活性的10%左右,抗FXa活性的4%左右；2)利用乳腺癌4T1细胞试验转移模型,分析NER-CS在小鼠体内抗肿瘤转移活性,结果显示：50、100和200μg NER-CS的抑瘤率分别为54.3±2.5%、75.1±3.5%、42.9±2.1%,同时阳性对照100μg肝素的抑瘤率为74.6±1.8%；3)用亲和素修饰的CM5芯片固定生物素化NER-CS,分析NER-CS与五种生长因子、三种选择素的相互作用活性,结果显示NER-CS与生长因子HGF、bFGF相互作用活性较高,亲和力常数分别为(3.47±1.73)x10-6、(5.39±2.92)x10-8。4. NER-CS寡糖的制备及其抗肿瘤活性分析：建立了一种制备CS寡糖的方法,采用高酶活的rHCLase,通过单因子实验优化了降解产生E-unit CS寡糖所需的酶用量与反应时间,分离纯化出不同聚合度的系列CS寡糖,分析了二糖组成,最后检测了系列寡糖的抗肿瘤活性。结果表明120 mg NER-CS和口40μg的rHCLase在含05 M NaCl的PBS反应液中,于37℃下反应8h后可获得聚合度为2-18的系列寡糖,100 μg的NER-CS八糖、十糖、十二糖、十四糖及多糖的抑瘤率分别为70.3±3.8%、74.0±2.6%、83.2±3.6%、74.8±4.6%和75.7±3.7%。综上所述,本课题优选成本低廉、产量大的美洲大赤鱿软骨为原料,建立了NER-CS的制备方法,得到了富含E-unit新型CS。NER-CS与生长因子HGF、 bFGF存在强的相互作用,抗凝血活性低,具有强的抗肿瘤转移活性；进一步通过优化制备NER-CS寡糖方法,制备出不同聚合度系列寡糖,发现十二糖抑瘤率最高。本研究为研发CS类抗肿瘤转移医药保健产品提供了有益参考。
[Abstract]:A new type of CS - E - rich CS - E , which is rich in E - unit , is prepared by using CS - oligosaccharide as raw material . A new type of CS was prepared . The yield of the final product reached 16 卤 2 % . The results showed that the new CS content was more than 97 % and the content of protein was lower than 2 % . The tumor - inhibiting rates of 50 , 100 and 200 渭g NER - CS were 54.3 卤 2.5 % , 75.1 卤 3.5 % , 42.9 卤 2.1 % , respectively . The preparation and anti - tumor activity of NER - CS oligosaccharides : A method for preparing CS - oligosaccharide was established . The enzyme dosage and reaction time required for degrading E - unit CS oligosaccharides were optimized by single - factor experiments . The results showed that the inhibitory rates of these oligosaccharides were 70.3 卤 3.8 % , 74.0 卤 2.6 % , 83.2 卤 3.6 % , 74.8 卤 4.6 % and 75.7 卤 3.7 % , respectively .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R943;R96

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