腺苷A1和A2A受体介导的cAMP-PKA-CREB信号通路在大鼠酒精性肝纤维化HSC模型中的作用

发布时间：2018-02-09 22:25

本文关键词： 乙醛腺苷受体肝星状细胞环磷酸腺苷蛋白激酶A 环磷腺苷酸反应元件结合蛋白　出处：《安徽医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病，酒精性肝纤维化是ALD进展为酒精性肝硬化的中间阶段和必经病理过程，如何预防和逆转其形成已成为学术界关注的热点。在酒精性肝纤维化发生过程中，乙醇可通过其代谢产物乙醛激活肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)。活化的HSC是肝纤维化过程中细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的主要来源，也是各种因素所致肝纤维化发生的中心环节。因此，抑制HSC的活化和增殖是目前治疗肝纤维化的主要策略。近年来，随着腺苷受体(adenosine receptors, ARs)亚型选择性激动剂和拮抗剂的开发，人们对腺苷及其受体的作用研究越来越深入，并逐步认识到腺苷A1(adenosine A1receptor, A1R)和A2A受体(adenosine A2A receptor, A2AR)在酒精性脂肪肝以及肝纤维化的发病机制中发挥不可忽视的作用。Chan等研究发现经乙醇诱导后释放的大量腺苷通过激活HSC腺苷A2AR，促进大鼠和人HSC胶原合成，Peng等研究表明缺乏或阻断腺苷A1R可减少小鼠酒精性脂肪肝的发生。本课题组前期研究也表明Caffeine作为非选择性腺苷受体拮抗剂能够显著抑制乙醛诱导的HSC-T6活化，并且显著降低HSC-T6中TGF-β1和CTGF的表达水平，其机制可能与拮抗腺苷A2AR介导的信号通路有关。因此，我们推测在酒精性肝纤维化形成过程中，腺苷A1R与A2AR均可能调控HSC活化增殖。但由于对cAMP-PKA依赖途径的相反调节作用，二者可能具有不同的效应。为进一步阐明腺苷A1R与A2AR信号通路调控HSC活化增殖的作用，本研究采用乙醛干预正常大鼠分离的HSC，制备离体大鼠酒精性肝纤维化HSC模型；并在此基础上，观察HSC腺苷A1R和A2AR表达水平，以及腺苷A1R和A2AR介导的cAMP信号通路调控HSC活化增殖的作用。主要内容概括如下： 1.HSC的分离、培养与鉴定取雄性Sprague-Darwley(SD)大鼠(300-450g)，10%水合氯醛(3ml/kg)麻醉，常规消毒，分离门静脉并插管，采用链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶依次灌注，37℃原位消化，经Nycodenz密度梯度离心分离HSC，在含20%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM中培养，隔天更换培养液。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活力，并分别于1d，2d，7d和14d进行拍照，鉴别细胞的分化程度。结果显示，HSC得率为1×107个/肝，HSC存活率为95%。 2.腺苷A1R和A2AR在大鼠酒精性肝纤维化HSC模型中的表达由前期研究可知，乙醛在200μM，作用48h时，HSC增殖最为明显。因此我们选之作为离体大鼠酒精性肝纤维化HSC模型的的造模条件，并同时设正常HSC对照组，采用实时定量PCR法及Western blot法检测HSC中腺苷A1R和A2AR表达水平。结果显示，腺苷A1R和A2AR在正常HSC均有表达，且腺苷A2AR表达水平明显高于A1R；与正常组比较，经200μM乙醛作用48h后，HSC模型组腺苷A1R和A2AR表达水平明显增高。结果表明，大鼠酒精性肝纤维化HSC模型及正常大鼠分离的HSC均表达腺苷A1R和A2AR，且在HSC模型组表达明显增高。 3.腺苷A1R介导的cAMP信号通路在大鼠酒精性肝纤维化HSC模型中的作用将HSC按1×105个/ml密度接种于24孔培养板，常规培养24h后，随机分组进行实验。实验设正常对照组(常规培养)，模型组，百日咳毒索(pertussis toxin, PTX)组，非选择性ARs激动剂NECA组，NECA+PTX组。除正常对照组外其余各组均以200μM乙醛作用48h，制备大鼠酒精性肝纤维化HSC模型。然后PTX组及NECA+PTX组给予PTX(100ng/ml)预处理HSC24h，在此基础上，NECA组及NECA+PTX组再给予NECA(10μM)与HSC共培养10min，ELISA法检测HSC内cAMP含量，Western blot法检测PKA及磷酸化CREB蛋白的表达。结果显示，与正常组比较，模型组cAMP含量及其信号通路中关键信号分子PKA、磷酸化CREB蛋白的表达明显升高，PTX和NECA均能进一步升高模型组cAMP含量，以及PKA和磷酸化CREB蛋白的表达，且PTX预处理显著增强NECA的效应。结果提示，在HSC存在AR-Gi/o-AC-cAMP信号通路，PTX作为Gi/o蛋白耦联受体抑制剂，通过抑制Gi/o-AC-cAMP通道，进而加强了非选择性ARs激动剂经A2AR-Gs-AC-cAMP通道促进cAMP生成的作用。为进一步阐明腺苷A1R及其介导的cAMP信号通路在大鼠酒精性肝纤维化HSC模型中的作用，分别以腺苷A1R激动剂CPA (1μM)、腺苷A1R拮抗剂DPCPX(10nM)、CPA+DPCPX与HSC模型共培养48h，采用实时定量PCR法及Western blot法检测α-SMA、Collagen I、Collagen III的表达情况。结果显示经乙醛作用48h后，模型组HSC α-SMA、Collagen I、Collagen III表达明显增强，经DPCPX处理后均明显下降，而CPA作用能进一步促进模型组HSC α-SMA、Collagen I、Collagen III表达水平。同时，与单独用药组比较，CPA+DPCPX联合用药组上述作用明显逆转。结果表明乙醛可能通过激活HSC内腺苷A1R促进HSC活化增殖，腺苷A1R拮抗剂对其具有一定的抑制作用。进一步研究显示，经CPA处理后，模型组HSC中cAMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表达明显下降。而DPCPX作用能进一步升高模型组cAMP含量及PKA、磷酸化CREB蛋白表达水平。同时，与单独用药组比较，CPA+DPCPX联合用药组上述作用明显逆转。结果表明A1R-Gi/o-AC-cAMP-PKA-CREB信号通路在乙醛诱导的HSC活化增殖中具有一定的作用。 4.腺苷A2AR介导的cAMP信号通路在大鼠酒精性肝纤维化HSC模型中的作用将HSC按1×105个/ml密度接种于24孔培养板，常规培养24h后，随机分组进行实验。实验设正常对照组(常规培养)，模型组，磷酸二酯酶(IV)抑制剂Rolipram组，NECA组，NECA+Rolipram组，除正常对照组外其余各组均以200μM乙醛作用48h，制备大鼠酒精性肝纤维化HSC模型。然后Rolipram组及NECA+Rolipram组给予Rolipram(10μM)预处理HSC15min，在此基础上，NECA组及NECA+Rolipram组再给予NECA(10μM)与HSC共培养10min，，ELISA法检测HSC内cAMP含量，Western blot法检测PKA及磷酸化CREB蛋白的表达。结果与前述一致，与正常组比较，模型组cAMP含量及其信号通路中关键信号分子PKA、磷酸化CREB蛋白的表达明显升高，Rolipram和NECA均显著升高模型组cAMP含量，以及PKA和磷酸化CREB蛋白的表达，Rolipram+NECA则具有进一步的升高作用。细胞内cAMP含量增高主要有两条途径：一是激动ARs；二是抑制胞内磷酸二酯酶的活性，研究结果表明Rolipram作为磷酸二酯酶(IV)抑制剂显著增加cAMP含量，而NECA作为非选择性AR激动剂同样显著增加cAMP含量，提示在HSC存在AR-Gs-AC-cAMP信号通路。为进一步阐明腺苷A2AR及其介导的cAMP信号通路在大鼠酒精性肝纤维化HSC模型中的作用，分别以腺苷A2AR激动剂CGS21680(1μM)、腺苷A2AR拮抗剂ZM241385(1μM)以及CGS21680+ZM241385与HSC共培养48h，采用实时定量PCR法及Western blot法检测α-SMA、Collagen I、Collagen III的表达情况。结果显示经乙醛作用48h后，模型组HSC α-SMA、Collagen I、Collagen III表达明显增强，经ZM241385处理后均明显下降，而CGS21680作用能进一步促进模型组α-SMA、Collagen I、Collagen III表达水平。同时，与单独用药组比较，ZM241385+CGS21680联合用药组上述作用明显逆转。结果表明乙醛可能通过激活HSC内腺苷A2AR促进HSC活化增殖，腺苷A2AR拮抗剂对其具有一定的抑制作用。进一步研究显示，经ZM241385处理后，模型组HSC中cAMP含量及PKA、p-CREB蛋白表达明显下降。而CGS21680作用能进一步升高模型组cAMP含量及PKA、p-CREB蛋白表达水平。同时，与单独用药组比较，ZM241385+CGS21680联合用药组上述作用明显逆转。结果表明A2AR-Gs-AC-cAMP-PKA-CREB信号通路在乙醛诱导的HSC活化增殖中具有一定的作用。综上所述，在大鼠酒精性肝纤维化HSC模型中，腺苷A1R和A2AR表达水平均较正常HSC明显增强，腺苷A1R和A2AR共同参与调控酒精性肝纤维化中HSC的活化增殖，腺苷A1R和A2AR拮抗剂对酒精性肝纤维化中HSC活化增殖均具有显著的抑制作用，但二者对cAMP-PKA-CREB信号通路具有相反的调节作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R965

【参考文献】