松茸和三色雷蘑血管紧张素转换酶抑制剂的分离纯化、结构及生物活性研究

发布时间：2018-02-10 15:46

  本文关键词： ACE 抑制肽 ACE 抑制蛋白 抑制类型 原发性高血压大鼠 松茸 三色雷蘑　出处：《中国农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：高血压是影响人类健康的“无形杀手”,对高血压疾病的防治及治疗药物的研究是全球医学界面临的一项艰巨任务。血管紧张素转换酶(ACE)是肾素-血管紧张素(RAS)和激肽释放酶-激肽(KKS)这两个血压调控系统中起关键作用的酶。因此寻找安全性高且副作用小的食源性ACE抑制剂(ACEI)药物成为一个热门课题。食用菌不仅味道鲜美可口、营养丰富,还具有很高的药用价值,因此对食用菌中ACEI药物的研究有着广泛的应用前景。本研究分别从松茸和三色雷蘑的子实体中分离纯化得到一种ACE抑制肽TMP和一种ACE抑制蛋白LTP,并且对其结构、生理生化特性及生物学活性进行了研究。综合运用加热提取、超滤、离子交换层析及凝胶过滤层析的分离纯化手段,从松茸子实体中得到一个具有较高ACE抑制活性的肽段,命名为TMP,并且通过LC-MS/MS质谱分析得到其氨基酸序列为WALKGYK,分子量为865.04 Da,对ACE的IC50值为0.4μM。TMP在40-90℃具有良好的温度稳定性,90℃条件下孵育2 h对ACE仍有80%的抑制活性。在pH 2.0-11.0范围内也具有较好的稳定性,在pH 2.0的酸性条件下,仍然保留40%的ACE抑制活性。通过Lineweaver-Burk动力学模型测试,TMP属于非竞争性抑制剂。TMP在10mg/kg时表现出50%的DPPH自由基清除活性,20 mg/mL时对亚铁离子有24%的螯合能力。在单剂量短期原发性高血压大鼠(SHR)的体内降血压实验中,TMP和松茸水提物对SHR大鼠都具有降血压效果,其有效作用剂量分别是25 mg/kg和400 mg/kg,对SHR大鼠收缩压的降幅分别是18 mmHg和36 mmHgoTMP剂量为50 mg/kg时,对SHR大鼠收缩压的降幅为36 mmHg. TMP和松茸子实体水提物对大鼠的心率都没有影响。因此松茸及松茸ACE抑制肽TMP的研究为松茸开发成降血压功能性食品提供了理论依据。采用10 kDa超滤膜超滤、两次强阴离子交换柱层析及凝胶过滤层析的纯化技术,从三色雷蘑子实体中分离纯化出一个分子量为86 kDa的双亚基ACE抑制蛋白,命名为LTP,纯化倍数为12.7倍,回收率为0.9%,LTP对ACE的IC50值为1.64 mg/mL, N端序列为DGPTMHRQAVADFKQ,疏水性氨基酸比例为40%。采用LC-MS/MS质谱技术得到7条可信度较高的肽段氨基酸序列,并且这7条肽段的疏水性氨基酸残基所占比例最少为60%。LTP在pH 9.0的碱性环境孵育2 h后对ACE的抑制活性只有30%,在pH 2.0的酸性环境下孵育2 h后仍保留有60%的ACE抑制活性。LTP在不同温度下孵育2 h后,对ACE的抑制活性随温度的升高而逐渐降低,温度稳定性差。通过动力学参数Km和Vmax的变化及Lineweaver-Burk曲线测试,LTP属于竞争性抑制剂。三色雷蘑水提物和三色雷蘑ACE抑制蛋白LTP在200 mg/kg及100 mg/kg的剂量下,对SHR大鼠的收缩压都有显著的降低作用,其降幅分别是34 mmHg和43 mmHg,并且对大鼠的心率都没有影响。因此对三色雷蘑ACE抑制剂的研究为此食用菌的进一步开发利用提供了实验数据。
[Abstract]:Hypertension is an "invisible killer" affecting human health. The research on the prevention and treatment of hypertension is a difficult task facing the global medical community. ACE-ACE-RAS-renin-angiotensin (Ras) and angiotensin (ACE). Kallikrein (KKS) is a key enzyme in two blood pressure regulation systems. Therefore, it has become a hot topic to search for food source ACE inhibitor (ACEI) with high safety and small side effects. Edible fungi are not only delicious, but also delicious. It is rich in nutrition and has high medicinal value. In this study, a ACE inhibitory peptide TMP and a ACE inhibitor protein TMP were isolated from the fruiting bodies of Tricholoma tricolor and Tricholoma matsutake, respectively. The physiological and biochemical characteristics and biological activities of Tricholoma matsutake were studied. By means of heating extraction, ultrafiltration, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography, a peptide with high ACE inhibitory activity was obtained from the fruit body of Tricholoma matsutake. Its amino acid sequence was WALKGYK with molecular weight 865.04 Da. the IC50 value of ACE was 0.4 渭 M. TMP with good temperature stability at 40-90 鈩，

本文编号：1500870