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核酸特异识别与调控的含氮有机分子的设计、合成及活性研究

发布时间:2018-02-15 06:24

  本文关键词: 化学合成 人工核酸酶 非病毒基因载体 多胺 出处:《北京化工大学》2016年博士论文 论文类型:学位论文


【摘要】:分子生物学和分子药理学的发展使人们能够从基因水平理解某些生命现象,并通过合理的分子设计寻找有效的基因治疗药物或者有用的分子生物学工具。本论文以DNA为靶标分子构建了一系列多胺挂接型核酸调控试剂,并通过多种实验手段研究了其对核酸的识别、断裂及介导基因转运等方面作用,为进一步深入理解、研究、开发出性能优良的核酸断裂试剂及基因转运工具奠定基础。首先,选取两类典型的对核酸具有一定识别与断裂作用的多胺(Polyamine)配体分子即环状多胺(tacn、cyclen、cyclam)和刚性平面多胺(IDB),挂接到具有链状结构的聚天门冬氨酸(PASP)骨架上形成多胺修饰的聚天门冬氨酸衍生物(PASP-polyamine)类新型核酸调控试剂。旨在利用PASP的骨架结构,提高和增强配体分子对核酸的作用效果,同时赋予结构简单、可生物降解的PASP作为功能性材料的能力。采用胺解开环方法对PASP-polyamine进行合成,并通过NMR、ESI-MS、 MALDI-TOF等手段对关键中间体及终产物进行结构表征,同时采用核磁共振氢谱中特征峰的积分面积对PASP骨架上多胺的接枝率进行了计算。在活性评价过程中,首先采用琼脂糖凝胶电泳方法研究了PASP-polyamine (PASP-tacn、PASP-cyclen、PASP-cyclam、PASP-IDB)与DNA的作用情况,发现PASP-polyamine具有明显的调控核酸双链断裂能力,而在相同的条件下单独的配体分子和PASP均未显示核酸断裂能力。以PASP-cyclen为例,进一步的研究中发现PASP-cyclen(19.1 μM)在37℃、pH为7.4的缓冲溶液中作用3h即可对核酸的双链产生切割作用,且随着PASP-cyclen浓度的增加及反应时间的延长,线形Form Ⅲ DNA为主要存在形态,且这种切割能力是在无金属离子存在下、水解方式进行的特异性非随机性双链断裂。此外,进一步的构效关系表明,PASP-polyamine的核酸断裂能力的产生是受PASP骨架及骨架上裸露的羧基共同调控的。这一研究成果不仅丰富了人工核酸酶的研究内容,并且为设计高效的非金属类核酸断裂试剂提供了新的设计方法及设计思路。进一步,为了丰富多胺挂接型氨基酸聚合物类核酸调控试剂结构的多样性,在上述研究内容的基础上进一步以天门冬氨酸(Asp)和赖氨酸(Lys)嵌段共聚物为骨架接枝多胺类分子,设计合成了PAL-cyclen。通过调节Asp与Lys不同的投料比例,制备出Asp/Lys=4:1、1:1及1:4三种不同氨基酸嵌段比的PAL-cyclen,并采用NMR、FT-IR、元素分析、GPC等手段对所制备的聚合物进行全面的表征。初步的生物学评价表明,PAL-cyclen具有核酸凝聚作用,有望作为非病毒类基因载体。因此,为了考察PAL-cyclen在介导基因转运方面的能力,接下来我们进行了一系列相关的活性评价。采用琼脂糖凝胶电泳、圆二色谱和荧光淬灭光谱手段定性、定量的讨论了PAL-cyclen对DNA的亲和能力及对核酸的保护情况。借助原子力显微镜、DLS技术及Zeta电位研究了PAL-cyclen/DNA复合物表面性质及形态学。此外,对PAL-cyclen的体外细胞毒性及转染效率进行了评价。结果表明,PAL-cyclen与DNA能够通过静电作用结合,且所形成的复合物能够保护DNA免受脱氧核糖核酸酶的降解。进一步的形态学研究表明,PAL-cyclen与DNA可形成表面带正电荷、直径~100nm的纳米粒子,该粒径是作为基因载体的理想范围,有利于通过胞吞作用被细胞摄取。同时,PAL-cyclen对Hep G2细胞具有较低的细胞毒性,且能够有效的介导目的基因转运到Hep G2细胞并实现蛋白的表达。因此,这一研究内容在拓展多胺挂接型氨基酸类材料研究内容的同时,也为当前非病毒基因载体材料存在的高毒性、低效率等问题提供了一种可能的解决方法及设计方向。
[Abstract]:The development of molecular biology and molecular pharmacology makes people understand some life phenomena from the gene level, and through the molecular design of reasonable gene finding effective drugs or useful molecular biological tools. This paper takes DNA as a target molecule to construct a series of polyamine hanging type nucleic acid regulating reagent, and studied its recognition of nucleic acid through many experiments, fracture and mediated gene transfer and other aspects of the role, for further understanding, research, development and lay the foundation of nucleic acid cleavage reagents and gene transfer tools with excellent performance. Firstly, selecting two typical recognition and fracture effect on nucleic acid polyamine (Polyamine) ligands that ring more amine (TACn, cyclen, cyclam) and rigid polyamine (IDB), poly aspartic acid is attached to the chain structure (PASP) modified poly aspartate to form skeleton Amino acid derivatives (PASP-polyamine) type of nucleic acid reagents. The regulation aims to use the framework of PASP, improve and enhance the effect of nucleic acid ligands, as has the advantages of simple structure, biodegradable PASP as functional materials. By using the method of synthesis of amine ring opening PASP-polyamine, and through NMR, ESI-MS, MALDI-TOF means were used to characterize the structures of the key intermediates and the final products, and the integral area of NMR characteristic peak of grafted on PASP skeleton polyamine rate was calculated. In the activity in the process of evaluation, the first PASP-polyamine was analyzed by agarose gel electrophoresis method (PASP-tacn, PASP-cyclen, PASP-cyclam, PASP-IDB) and the role of DNA, found that PASP-polyamine can regulate DNA double strand breaks significantly, and under the same conditions of ligand and PASP were not alone Display of nucleic acid cleavage ability. In the case of PASP-cyclen, PASP-cyclen found that further studies (19.1 M) at 37 C pH 7.4 buffer solution in 3h of double stranded nucleic acid can produce the cutting action, and with the increase of PASP-cyclen concentration and reaction time, linear Form III DNA was the main existing and this kind of form, cutting ability is the presence of metal ions in no way, hydrolysis of specific non random double strand breaks. In addition, further the structure-activity relationship showed that the nucleic acid cleavage ability of PASP-polyamine is produced by PASP skeleton and bone frame to control exposed carboxyl groups. These results not only enrich the research content of artificial nuclease, and provides a new design method and design ideas for non metal reagents to design efficient nucleic acid cleavage. Further, in order to enrich the polyamine hanging type amino acid polymer class The diversity of nucleic acid control reagents structure, based on the content above the aspartic acid (Asp) and lysine (Lys) copolymer as skeleton graft polyamine molecules, PAL-cyclen. and Lys Asp by adjusting the different proportion of the material were designed and synthesized, the preparation of Asp/Lys=4:1,1:1 and 1:4 in three different amino acid block ratio of PAL-cyclen, and the NMR, FT-IR, elemental analysis, GPC and other means to conduct a comprehensive characterization of the prepared polymer. The preliminary biological evaluation showed that, PAL-cyclen has a nucleic acid condensation, is expected as a non viral gene vector. Therefore, in order to study PAL-cyclen mediated gene transfer in the next, we carried out a series of related activity evaluation. By agarose gel electrophoresis, round two chromatography and fluorescence quenching spectroscopy qualitative, quantitative discussion the affinity of DNA PAL-cyclen The protection of nucleic acid. Using an atomic force microscope, DLS and Zeta potential of the surface properties of PAL-cyclen/DNA composite and morphology. In addition, in vitro cytotoxicity and transfection efficiency of PAL-cyclen was evaluated. The results showed that PAL-cyclen and DNA can be combined by static electricity, and the degradation complex formed to protect DNA from DNase. Morphological studies further showed that PAL-cyclen and DNA can be formed on the surface of positively charged nanoparticles, diameter 100nm, the particle size range is ideal for gene delivery, to endocytosis ingested by the cells. At the same time, PAL-cyclen has low cytotoxicity on Hep cells and G2. Can express effectively mediated transport of target gene to Hep G2 cells and proteins. Therefore, the research content in the development of polyamine hanging type amino acids material research At the same time, it also provides a possible solution and design direction for the high toxicity and low efficiency of current non viral gene carrier materials.

【学位授予单位】:北京化工大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R91;R914.5

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本文编号:1512630

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