柿单宁基于AMPK和miRNA调节非酒精性脂肪肝和前脂肪细胞分化的分子机制

发布时间：2018-02-16 16:42

本文关键词： 柿单宁特征结构单元肝脂肪变性肥胖降脂脂肪生成　出处：《华中农业大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：本文旨在研究柿单宁对非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和前脂肪细胞分化的影响,确认柿单宁是否是柿及其提取物降脂的主体成分,并探讨柿单宁调控脂质代谢的机制。本文以高胆固醇饲料诱导大鼠肝脏脂肪积累,并结合体外实验,初步研究了柿单宁降脂及对肝脏脂肪聚集的影响,随后以高脂饲料(猪油+胆固醇)构建大鼠NAFLD模型,证实柿单宁是柿果改善NAFLD的主要功效成分,并采用动物模型及细胞体系(人正常肝细胞L02细胞及前脂肪细胞3T3-L1细胞),结合real time RT-PCR和western blot等分析技术对柿单宁调节NAFLD脂质代谢的信号通路进行了研究,比较了柿单宁及其结构特征单元对肝脂肪变性的影响及机制,探讨柿单宁的构效关系。主要研究结果如下： 1.柿单宁体内外降脂的作用为了研究柿单宁的降脂作用,我们采用高胆固醇饲料诱导大鼠高血脂及脂肪肝,研究柿单宁对血脂、肝脂的影响,并结合体外实验,研究了柿单宁对胰脂酶和胆固醇酯酶活性的影响以及柿单宁与胆固醇胶束化、胆汁酸的结合能力。结果表明,柿单宁能显著降低大鼠血清和肝脏中甘油三酯(TG),总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量,升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量；肝组织形态学显示柿单宁能降低肝脏脂肪的聚集,此外柿单宁还能增加血清中卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)的活性,促进粪便中胆酸的排泄。同时,我们也检测了抗氧化能力的相关指标,结果表明柿单宁能减轻高胆固醇饲料诱导的脂质过氧化,增强血清中抗氧化酶的活力。体外实验研究表明,柿单宁能抑制胰脂酶(ICs0为0.445mg/mL)和胆固醇酯酶(IC50为0.442mg/mL)的活性,柿单宁对胰脂酶的抑制类型为非竞争性抑制；柿单宁可降低胆固醇胶束化的溶解性,且与胆酸和脱氧胆酸具有较强的结合能力,能降低肠道对脂质和胆汁酸的吸收。这些结果表明柿单宁可能是柿及其提取物降脂的主体成分。 2.柿单宁是柿果基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)途径改善NAFLD的主体成分采用高脂(HF,38%的能量来自脂肪)饲料诱导大鼠NAFLD的形成,同时给予或不给予0.5%的柿单宁,4.2%的柿果冻干粉(含有相同量的柿单宁),研究柿单宁和柿果对NAFLD的影响及机理。实验9周后,我们发现,柿单宁和柿果均能显著降低(P0.05)大鼠血清TG和游离脂肪酸含量,升高HDL-C水平；增加粪便中TG、 TC和胆汁酸的排泄,改善肝脂肪变性和炎性细胞浸润。Real time RT-PCR结果表明,柿单宁和柿果还能显著(P0.05)下调脂肪生成相关基因的表达,如固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)和硬脂酰辅酶A脱氢酶1(SCD1);上调脂肪氧化相关基因的表达,如肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT1)。 Western blot结果显示,在柿单宁和柿果的作用下,肝脏中AMPK被显著(P0.05)激活。此外,柿单宁和柿果还能显著降低(P0.05)肝脏中炎症因子的含量和核因子kB (NFkB)的蛋白表达。提示柿单宁是柿果改善高脂诱导的肝脂肪变性和慢性炎症反应的主体成分,其作用机理与激活AMPK信号通路有关。 3.柿单宁基于miR-122和miR-33b调节人正常肝细胞L02单纯性脂肪积累我们以0.4mmo1/L的油酸诱导人正常肝细胞L02单纯性脂肪变性模型,研究柿单宁及其主要特征单元对脂质代谢的机制,结果表明,柿单宁及其主要特征单元能降低细胞内TG的积累,其中A型连接ECG二聚体、A型连接EGCG二聚体作用最强,与柿单宁作用相当,而A型连接EC二聚体和B型连接二聚体作用较弱。柿单宁及其主要特征单元降低L02细胞脂肪合成相关基因SREBP1C和脂肪酸合成酶(FAS)的表达,但并不增加脂肪酸氧化基因CPT1的表达和AMPK的磷酸化,提示其抑制L02细胞脂肪的积累不是通过AMPK信号通路实现的。并且柿单宁及其主要特征单元可抑制人肝细胞L02中niR-122和miR-33b以及下游脂肪合成相关基因SREBPIC和FAS的表达。柿单宁对以上基因表达的抑制从3h开始,而二聚体在0.5h时即可表现出很强的抑制作用。柿单宁通过niR-122和miR-33b抑制油酸诱导的L02肝细胞脂肪变性,这种作用主要归功于结构中ECG和EGCG单元以及黄烷醇的A型连接方式。 4.柿单宁基于lniR-27a/b抑制前脂肪细胞3T3-L1的分化柿单宁浓度为60μg/mL时对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的抑制率达到了68.6%,这种作用主要发生在细胞分化早期阶段,阻碍细胞的克隆扩增。柿单宁可降低前脂肪细胞分化过程中转录因子过氧化物酶增值激活受体γ (PPARγ)、 CCAAT增强子结合蛋白α (C/EBPα)和SREBP1C的表达,降低其下游基因FAS ACC1等的表达,且呈剂量依赖关系。柿单宁可上调前脂肪细胞3T3-L1中miR-27a和miR-27b的表达,其靶基因PPARy的蛋白表达也受到抑制。总之,柿单宁可通过调控miR-27a/b-PPARγ信号通路抑制前脂肪细胞的分化,减少细胞内脂肪的积累。 5.柿单宁主要特征单元基于miR-27a/b抑制前脂肪细胞3T3-L1的分化柿单宁中含量最为丰富的两种特征单元(A型连接ECG二聚体和EGCG二聚体)具有很好的抑制前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的效果,这种抑制作用主要发生在细胞分化早期阶段,阻碍有丝分裂克隆扩增(MCE)进程。A型连接EC二聚体也能在一定程度上抑制前脂肪细胞的成脂分化,但效果不如前两种,B型连接EC二聚体无此作用。A型连接ECG二聚体和EGCG二聚体可通过上调前脂肪细胞3T3-L1中miR-27a和miR-27b的表达,进而抑制其靶基因PPARγ的表达,下调FAS, SCD1等脂肪生成相关基因,减少细胞内脂肪的积累,最终阻碍前脂肪细胞的分化。这些结果显示,柿单宁对前脂细胞的抑制作用与其结构中含有丰富的A型连接ECG二聚体和EGCG二聚体密切相关。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

【参考文献】